Trabalho de Análise 2 - Análise de pigmentos naturais em ali

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOS ALIMENTOS 
ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISE DE PIGMENTOS NATURAIS EM ALIMENTOS POR 
CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
 
 
 
 
 
Alunos 
Pedro Henrique Nanni Resende 
Welbert de Freitas Reis 
Marcos 
Professor 
Cleiton Nunes 
 
LAVRAS 
MINAS GERAIS - BRASIL 
Maio de 2012
 
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Introdução 
 
 A cromatografia foi introduzida por um pesquisador russo, 
Michael Tswett, em 1906, quando ele separou clorofila de uma mistura de 
pigmentos de planta. Ele colocou uma pequena quantidade de amostra no 
topo de uma coluna de vidro cheia de carbonato de cálcio em pó, e então 
lavou a amostra com éter de petróleo. Conforme a amostra descia pela 
coluna, apareciam bandas separadas e de cores distintas. Daí vem o nome 
da técnica, pois, em grego, “cromo” significa “cor” e “grafia” significa 
“escrita”, o que quer dizer “escrevendo em cores”. Porém a cor foi 
característica nesse caso, mas em outros tipos de cromatografia pode 
existir separação dos componentes da amostra sem nenhum aparecimento 
de cor. (HELOISA CECCHI, 2009). 
 Muitos são os métodos existentes para a purificação e separação 
dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidos podemos citar a 
catação, dissolução, cristalização, recristalização fracionada, extração, 
destilação e a sublimação. Estes métodos são muito úteis, são largamente 
empregados em laboratórios e em indústrias com bons e/ou excelentes 
resultados. Mas falham, no entanto, quando os diversos componentes da 
mistura possuem constantes físicas semelhantes, isto é, pontos de fusão 
ou ebulição próximos, solubilidade semelhante em um mesmo solvente 
(ou mistura de solventes), etc. A cromatografia permite resolver este 
problema. 
A cromatografia é um método de separação de substâncias 
baseado na distribuição seletiva dos diferentes componentes de uma 
mistura entre duas fases imiscíveis. 
Os métodos cromatográficos permitem separar os componentes de 
uma mistura pois dependem da migração seletiva e diferencial dos solutos 
através de um sistema constituído de duas fases: uma sólida (ou fixa) e 
outra fluida (ou móvel). A fase sólida é denominada adsorvente e é 
estacionária. Adsorção é a capacidade de uma substância (o adsorvente) 
em deter ou concentrar seletivamente sobre a sua superfície, gases, 
 
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líquidos ou sólidos, podendo ser arrastados por uma fase móvel, 
denominada eluente. 
 
Cromatografia em Papel 
 
A cromatografia em papel, desenvolvida em 1944, é uma técnica 
simples e econômica de separação dos componentes de uma mistura, 
podendo, em alguns casos, ter uma aplicação qualitativa e quantitativa. 
Classifica-se como cromatografia líquida - líquida, e a separação ocorre 
por partição do soluto entre dois líquidos. 
Está baseada nas diferentes solubilidades relativas dos 
componentes da amostra na fase móvel (líquida) e na fase estacionária 
(líquida). Os componentes menos solúveis na fase estacionária têm uma 
movimentação mais rápida ao longo do papel, enquanto os mais solúveis 
serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta. 
Esta técnica cromatográfica é assim chamada porque utiliza para a 
separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a 
migração diferencial sobre a superfície de uma tira de papel filtro de 
qualidade especial. (HELOISA CECCHI, 2009). 
Este tipo de cromatografia é de execução muito simples e 
necessita quantidades muito pequenas das substâncias para realizar-se a 
análise. A amostra é aplicada na borda inferior de uma tira de papel filtro 
(cromatografia ascendente) ou na borda superior (cromatografia 
descendente). A seguir, a tira é colocada em contato com o eluente 
escolhido, cuidando para que o mesmo não entre em contato direto com a 
amostra, deixando que ascenda ou descenda pela superfície do papel 
filtro. A identificação das substâncias pode ser feita por visualização 
direta (quando possuem cor) ou pela utilização de reveladores adequados. 
(INSTITUTO DE QUÍMICA DA UFRGS, 2004). 
Este método é muito útil para separar substâncias muito polares 
como os açúcares e os aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se 
cromatografar somente pequenas quantidades das substâncias por vez. 
Na cromatografia existem duas fases: 
 
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 Fase estacionária: utiliza como suporte folhas de papel filtro 
especiais para cromatografia que variam quanto à espessura em 
milímetros; 
 Fase móvel: o eluente é um solvente puro ou uma mistura de 
solventes. Os principais eluentes são: éter de petróleo, tetracloreto 
de carbono, benzeno, éter etílico, cicloexano, acetato de etila, 
clorofórmio, etanol, acetona, matanol. 
 
Frequentemente inicia-se os teste de separação empregando um 
solvente apolar, e gradualmente aumenta-se a polaridade. Pode-se usar 
mistura de solventes, e ir-se alterando a proporção de um solvente polar 
em um apolar, contanto que sejam miscíveis entre si. 
 
Tipos de Desenvolvimentos 
 
Ascendente – A forma mais simples de cromatografia em papel é 
a cromatografia ascendente que utiliza uma tira de papel de comprimento 
e largura variáveis, em função da cuba cromatográfica a ser utilizada. 
Marca-se com lápis o ponto de partida da amostra, a uns 2 cm de uma das 
bordas do papel, e marca-se a linha de chegada da fase móvel (ou frente 
do solvente), geralmente distante 10-12 cm do ponto de partida. Nesse 
caso, deixa-se 2 cm de distância das bordas laterais e um intervalo entre 
os pontos de aplicação de 1,5 a 2,0 cm. O nível da fase móvel deve ficar 
abaixo do ponto de partida da substância, devendo, sempre, haver uma 
boa vedação da cuba cromatográfica para que não se perca o vapor dessa 
fase. 
Por capilaridade, a fase móvel começa a movimentar-se em fluxo 
ascendente, rapidamente no início, diminuindo gradativamente até parar 
por completo, quando a força ascendente da capilaridade for neutralizada 
pela ação da gravidade. Quando a fase móvel atingir a linha de chegada 
geralmente a 10-12 cm do ponto de partida, retira-se o papel da cuba 
cromatográfica e seca-se a tira de papel com secador, com ar quente ou 
frio, até eliminar-se a fase móvel. No caso de mistura de substâncias de 
 
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componentes coloridos, à medida que ocorre a separação, a cor única se 
desdobrará em cores distintas em função do número de substâncias que 
compõem, como, por exemplo, a separação de corantes artificiais em 
produtos alimentícios. No caso de mistura de substâncias incolores, 
podem-se detectar (revelar) esses componentes por técnicas diversas. 
Descendente – As manchas são colocadas na parte de cima do 
papel e este é colocado numa pequena cuba com solvente. O solvente 
desce por capilaridade e gravidade e, por isso, essa técnica é mais rápida, 
porém necessita de um equipamento mais complexo e específico. 
Horizontal (Circular) – O solvente é colocado no centro do papel e 
as manchas em volta desse centro. A separação se dá de maneira circular. 
Não é uma técnica muito utilizada em comparação com as outras duas 
descritas. 
Bidimensional – Numa primeira etapa, a fase móvel é deslocada 
ascendentemente e, depois, numa segunda etapa, gira-se o papel 90° e 
faz-se um novo deslocamento ascendente. Pode ser aplicada somente uma 
mancha em cada separação cromatográfica, podendo-se aplicar padrões 
somente na segunda eluição. (HELOISA CECCHI, 2009). 
 
Vantagens 
 
Simples e econômica; 
Ultiliza pequena quantidade de amostra; 
Boa capacidade de resolução; 
Praticidade (pode recortar o papel). 
(HELOISA CECCHI, 2009). 
 
Técnicas Analíticas da Cromatografia em Papel 
 
A amostra, que deve preferencialmente ser dissolvida em um 
solvente volátil, é aplicada com capilar, em um volume em µL.As 
quantidades de amostra variam de 1 a 100 mg, e a mancha no papel deve 
ter um diâmetro máximo de 0,5 cm. (HELOISA CECCHI, 2009). 
 
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Preparação Do Papel 
 
Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras 
em tamanhos que possam ser contidos nas cubas. 
É importante cortar o papel seguindo o eixo das fibras, pois a 
celulose está orientada neste sentido, o que facilitará a passagem da fase 
móvel. 
As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a 
saturação interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, 
sendo que esta última é mais rápida e consome menos eluente. Apenas 2 
cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia 
ascendente. 
Uma separação adequada dos componentes de uma mistura está 
relacionada com: 
 A difusão em função da concentração: formação de cauda em 
concentrações muito altas, com movimentação do soluto de região 
de maior concentração para região de menor concentração 
(espalhamento); 
 Difusão lateral: Quando soluto e fase móvel percorrem distancias 
diferentes (percursos laterais em determinadas regiões do papel); 
 Equilíbrio incompleto: Não da um tempo ideal de contato do 
soluto entre a fase móvel e a fase estacionária por causa de fluxo 
rápido; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRIMEIRO ARTIGO CIENTÍFICO: ANÁLISE DE PIGMENTOS DE 
PIMENTÕES POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
 
Segundo artigo citado por Núbia Moura Ribeiro e Carolina 
Rodeiro Nunes, os carotenóides são pigmentos naturais que trazem 
benefícios para a saúde por sua atividade antioxidante e anticancerígena. 
A cromatografia em papel é utilizada neste trabalho para separar e 
identificar esses pigmentos em extratos de pimentões verdes, amarelos e 
vermelhos. São apresentadas também informações sobre carotenóides, 
destacando os encontrados nos pimentões. 
 
Resenha 
 
Os métodos cromatográficos são utilizados para separar misturas 
contendo duas ou mais substâncias ou íons, e baseiam-se na distribuição 
diferencial dessas substâncias entre duas fases: uma das quais é 
estacionária e a outra, móvel (Fonseca e Gonçalves, 2004). 
Atualmente as diferentes modalidades de cromatografia são 
responsáveis por mais de 70% das análises em Química Analítica (Aqui-
no Neto e Nunes, 2003). Uma dessas modalidades é a cromatografia em 
papel (CP). Trata-se de uma técnica simples para análise de amostras em 
pequenas quantidades, aplicada principalmente na separação e 
identificação de compostos polares, tais como açúcares, antibióticos 
hidrossolúveis, aminoácidos, pigmentos e íons metálicos (Aquino Neto e 
Nunes, 2003). 
É considerada uma técnica de partição líquido-líquido. O papel 
consiste de celulose que pode absorver até 22% de água. É a água 
absorvida que funciona como fase estacionária líquida que interage com a 
fase móvel também líquida (Aquino Neto e Nunes, 2003). Os 
componentes da amostra são separados entre a fase estacionária e a fase 
móvel em movimento no papel. Os componentes que têm capacidade de 
formar ligações (ou “pontes”) de hidrogênio migram mais lentamente 
(Collins e cols., 2006). 
 
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O objetivo deste trabalho é utilizar a cromatografia em papel para 
separar os pigmentos de pimentões verdes, amarelos e vermelhos 
correspondentes às diferentes zonas cromatográficas. 
A coloração do pimentão se deve a capacidade de sintetizar 
carotenoides e de reter pigmentos de clorofilas (Collera-Zuniga e cols., 
2005). Os pimentões verdes e amarelos devem sua coloração princi-
palmente à presença de carotenos e de carotenoides oxigenados como as 
criptoxantinas (Bianchini e Penteado, 1998). Os pimentões vermelhos 
devem sua coloração pela presença de carotenoides polioxigenados, tais 
como as capsantinas e capsorubina (Curl, 1962). 
Os carotenoides são pigmentos encontrados na natureza e trazem 
benefícios para a saúde por sua atividade antioxidante e anticancerígena, 
e são classificados em carotenos (carotenoides hidrocarbonetos) e 
xantofilas (carotenoides oxigenados). A coloração dos carotenoides varia 
do amarelo, passando pelo laranja, até o vermelho intenso e resulta da 
multiplicidade de duplas ligações conjugadas (Bianchini e Penteado, 
1998). 
No procedimento experimental, os pimentões verdes, amarelos e 
vermelhos foram picados em pedaços pequenos. Foram pesados cerca de 
30 g dos pedaços de cada pimentão, aos quais foram adicionados 10 ml de 
acetona e 50 ml de hexano. As misturas foram maceradas separadamente, 
em gral de porcelana com pistilo, e deixadas em repouso por 1 hora. 
Após esse período, as misturas foram filtradas em funil comum, 
com papel de filtro pregueado Whatmann nº 1 e, em seguida, as fases 
aquosas dos filtrados foram separadas em funil de separação, resultando 
cerca de 30 ml de cada uma das fases hexânicas. Sulfato de sódio anidro 
foi adicionado a essas fases orgânicas que, após filtração, foram 
concentradas até o volume de 1 ml, com aquecimento em banho-maria 
mantido a 70 ºC e sob agitação. 
O concentrado resultante de cada extrato foi aplicado em fita de 
papel preparada com papel de filtro Whatmann nº 1, com dimensões de 
3,0 por 8,5 cm. Uma gota de cada amostra foi aplicada, com um capilar, 
 
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próxima à base do papel (cerca de 1 cm acima da borda), cuidando para 
que o diâmetro da mancha não ultrapassasse 0,5 cm. 
A cuba cromatográfica foi preparada com um recipiente cilíndrico 
de vidro com tampa e contendo um pedaço de papel de filtro embebido 
com fase móvel, deixando a atmosfera interna do recipiente saturada com 
vapores da fase móvel para facilitar a “corrida” cromatográfica. Após a 
evaporação do solvente no qual a amostra estava diluída para aplicação, a 
fita de papel foi posicionada na cuba cromatográfica de modo que o nível 
da fase móvel ficasse abaixo do ponto onde a amostra havia sido aplicada. 
Os extratos aplicados foram eluídos com hexano com 5% de acetona e 
foram obtidos os cromatogramas 1, 2 e 3. 
Nos resultados e discussões do artigo, a extração dos pimentões 
com hexano: acetona 5:1 fornece extratos contendo os principais 
pigmentos dos pimentões: carotenos, criptoxantinas, capsantinas e 
capsorubina (Collera-Zuniga e cols., 2005). Os carotenos, como o beta-
caroteno, têm pouca afinidade com a fase estacionária e maior afinidade 
com a fase móvel utilizada nesse experimento, contendo hexano com 5% 
de acetona, portanto, são eluídos com facilidade pela fase móvel e são os 
que, durante a “corrida” cromatográfica, mais se distanciam do ponto de 
aplicação da amostra. 
As criptoxantinas apresentam um grupamento hidroxila e têm 
moderada afinidade com a fase estacionária utilizada nesse experimento, 
já que a hidroxila pode formar ligações de hidrogênio com a água 
adsorvida no papel. Assim, as criptoxantinas e outras xantofilas 
apresentam certa tendência à retenção pela fase estacionária e, durante a 
“corrida” cromatográfica, distanciam-se moderadamente do ponto de 
aplicação da amostra. 
As capsantinas e a capsorubina são substâncias polioxigenadas e, 
portanto, têm maior afinidade com a fase estacionária da cromatografia 
em papel. Apresentam maior tendência à retenção pela fase estacionária e, 
durante a “corrida” cromatográfica, pouco se distanciam do ponto de 
aplicação da amostra. 
 
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Em resumo, há três regiões em cada cromatograma dos extratos 
dos pimentões: 
a) a dos carotenos; 
b) a das xantofilas monooxigenadas; 
c) a das capsantinas e da capsorubina. 
Além disso, pode-se perceber que o cromatograma do pimentão 
amarelo apresenta principalmente carotenos, capsantinas, capsorubina e 
outras xantofilas mais polares; o do pimentão verde apresenta 
principalmente criptoxantinase outras xantofilas de menor polaridade; o 
cromatograma do pimentão vermelho apresenta as três regiões intensas, 
indicando a presença de carotenos, criptoxantinas, capsantinas, 
capsorubina e outras xantofilas mais polares. 
Concluindo, a cromatografia em papel de extratos de pimentões 
permite a visualização da separação cromatográfica dos principais 
pigmentos existentes no extrato: os carotenos, as criptoxantinas, as 
capsantinas e a capsorubina. Além de despertar o interesse pela química 
de produtos naturais abordando carotenoides, o experimento dá margem a 
discussões elucidativas sobre interações intermoleculares, polaridade e 
funções orgânicas. A simplicidade do experimento torna sua realização 
viável em laboratórios que não dispõem de muitos recursos materiais. 
(NÚBIA MOURA E CAROLINA RODEIRO, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SEGUNDO ARTIGO CIENTÍFICO: APLICAÇÃO DA 
CROMATOGRAFIA EM PAPEL NA SEPARAÇÃO DE CORANTES 
EM PASTILHAS DE CHOCOLATE 
 
De acordo com artigo publicado por Leonardo Fernandes Fraceto 
e Sílvio Luís Toledo de Lima, este artigo descreve um experimento 
bastante simples, capaz de introduzir o estudante a um dos mais 
importantes métodos de separação, efetuado maciçamente em laboratórios 
de análises químicas em diferentes ramos da ciência: a cromatografia. A 
importância desse tema está na aliança entre duas facetas fundamentais da 
Química: interações intermoleculares e métodos de separação de 
componentes de uma mistura complexa. Aborda-se a separação de 
diferentes corantes alimentícios presentes em pastilhas de chocolate. 
 
Resenha 
 
A cromatografia é um método de analise que ocupa um lugar de 
destaque em vários campos da ciência (Química, bioquímica, engenharia 
de alimentos etc) devido a sua praticidade de efetuar separações, 
permitindo identificar e quantificar variadas misturas de compostos 
químicos. 
Em toda cromatografia, distingue-se uma fase estacionária e uma 
fase móvel. A primeira consiste em uma substancia que absorve a mistura 
sob exame, a segunda é a substancia (geralmente liquida) que induz a 
migração da mistura. Existem vários tipos de cromatografia: em camada, 
em coluna, e em papel, entre outras. Trataremos aqui da cromatografia em 
papel, na qual uma tira de papel poroso é usado comma o suporte na fase 
estacionária. 
Seguindo os princípios que regem essa técnica, será demonstrado 
neste experimento como separar e analisa, utilizando a cromatografia em 
papel, corantes alimentícios em pastilhas de chocolate. 
Neste experimento, é possível observar que cada um dos corantes 
apresenta uma migração sobre o papel (fase estacionaria). No momento 
 
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em que a fase móvel se desloca de maneira ascendente sobre o papel, há 
processos de interações intermoleculares entre os componentes em 
analise, os corantes e as duas outras substancias da fase estacionaria e da 
fase móvel. Em função das características de cada corante, ocorrera 
diferença entre as intensidades de interações. 
Caso um determinado corante apresente uma alta polaridade 
ocorrera uma interação maior com o papel (fase estacionário) do que com 
a solução da fase móvel, desta forma, a migração deste corante ocorrera 
mais lentamente se comparada a de um outro que apresenta uma 
polaridade menor. 
Este experimento pode ser usado também na identificação 
comparativa desses corantes artificiais de pastilhas de chocolate com os 
de outros produtos alimentícios como suco em pó e outros. (LEONARDO 
FERNANDES E SÍLVIO TOLEDO, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências Bibliográficas 
 
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PEREIRA, A.; CAMÕES, F. Ciências Físico-Químicas, 10º ano. Texto 
Editores, 2004.