[Cromatografia Gasosa] Padronização de método utilizando a cromatografia a gás

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Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences
vol. 37, n. 3, set./dez., 2001
Padronização de método utilizando a cromatografia a gás para
determinação quantitativa de imipramina e desipramina em amostras de
soro para fins de monitorização terapêutica
Adriano Cressoni Araujo*, Rosemary Custódio Pedroso
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo
Antidepressivos tricíclicos são eficazes e de custo acessível e, não
obstante seus efeitos colaterais, são ainda usados no tratamento
da depressão. Devido ao fato de apresentarem variações
consideráveis de cinética e faixa terapêutica estreita, a
monitorização terapêutica se faz necessária, para evitar efeitos
sub-terapêuticos ou tóxicos. Neste trabalho foi desenvolvido um
método para quantificação de imipramina e desipramina em
amostras de soro utilizando a cromatografia gasosa com coluna
capilar e detetor de nitrogênio e fósforo com finalidade de
monitorização terapêutica. Nas condições padronizadas
imipramina, desipramina e padrão interno (clomipramina) eluiram
com tempos de retenção de 7,043, 7,515 e 10,579 min
respectivamente. A linearidade do método na faixa de concentração
de 50 a 500 ng/mL apresentou coeficientes de determinação de
0,9998 para imipramina e 0,9999 para desipramina. Os coeficientes
de variação de 6,4% (±0,036) e 4,7% (±0,023) para imipramina e
6,9% (±0,037) e 7,1% (±0,039) para desipramina foram
encontrados em estudos de precisão intra-ensaios e interensaios
respectivamente. Limites de detecção de 15 ng/mL para imipramina
e 20 ng/mL para desipramina e limites de quantificação de 25 ng/mL
para imipramina e 40 ng/mL para desipramina foram observados
em amostras adicionadas. A recuperação absoluta foi de 73,7%
para imipramina e 70,6% para desipramina e a recuperação
relativa de 90% para ambas. A inexatidão foi de 5,32% e 7,91%
para imipramina e desipramina respectivamente. A estabilidade
dos analitos em soro foi de uma semana.
Unitermos:
• Depressão
• Imipramina
• Desipramina
• Monitorização terapêutica
• Cromatografia gasosa
• Detetor de nitrogênio e
• fósforo.
INTRODUÇÃO
A depressão é um dos transtornos mentais mais co-
muns, principalmente em idosos, necessitando muitas
vezes ser tratada com medicamentos (Baldessarini, 1996;
Furlanut et al., 1993)
A imipramina tem grande importância no tratamen-
to deste distúrbio. O custo acessível e o fato de haver um
*Correspondência:
A.C. Araújo
Avenida Padre Atílio, 346 - Belvedere
Araras/SP - CEP 13.601-100
email: araujo@siteplanet.com.br
A. C. Araujo, R. C. Pedroso322
conhecimento acumulado sobre seus efeitos farmacoló-
gicos fazem com que muitos clínicos prefiram indica-la ao
invés de antidepressivos desenvolvidos recentemente
(Aymard et al., 1998; Chattergoon et al., 1998; Ereshefsky
et al., 1995; Hackett et al., 1997; Torre et al., 1998).
Porém, variações interindividuais de cinética,
interações medicamentosas e idade, tornam difícil o ajuste
da dosagem, que associado a faixa terapêutica estreita
pode fazer com que ocorram desde efeitos sub-terapêu-
ticos até tóxicos (Ereshefsky et al., 1995; Sallee, Pollock,
1990). Desta maneira, a monitorização terapêutica da
imipramina auxilia o clínico no ajuste da dosagem corre-
ta (Linder, Keck, 1998; Toney, Ereshefsky, 1995). Para a
quantificação de imipramina existem diversos procedi-
mentos. Técnicas imunológicas e cromatográficas são as
mais citadas na literatura para quantificação de imipra-
mina em soro. No entanto, as primeiras apresentam-se
potencialmente capazes de dar reações cruzadas e dentre
elas muitas não quantificam separadamente o fármaco e o
seu produto de biotransformação. Técnicas cromatográ-
ficas são muito utilizadas tendo como vantagem maior
especificidade. (Chaternoon et al., 1998). A cromatografia
gasosa com coluna capilar permite a separação da
imipramina, seus produtos de biotransformação e outros
fármacos que poderiam estar presentes na amostra sem a
necessidade de derivação química e em tempo de análise
relativamente curto, com desempenho cromatográfico
satisfatório para aminas terciárias (imipramina) e secun-
dárias (desipramina) (Hattori et al., 1990; Pommier et al.,
1997; Torre et al., 1998; Tserng et al., 1998). Assim, neste
trabalho foi padronizado e validado um método para
quantificação de imipramina e desipramina por cromato-
grafia gasosa com coluna capilar e detetor de nitrogênio e
fósforo em amostras de soro com finalidade de monito-
rização terapêutica de pacientes sob terapia antidepressiva
com imipramina.
MATERIAL E MÉTODOS
Soluções-padrão
Padrões de embonato de imipramina (Novartis
Biociências S/A - Resende/RJ), cloridrato de desipramina
e cloridrato de clomipramina (Novartis Biociências S/A -
Basiléia Suíça), com grau de pureza superior a 97,5%. A
partir deste foram preparadas soluções estoque de
imipramina, desipramina e clomipramina a 0,1%
(1 mg/mL) em metanol e soluções de trabalho de imipra-
mina e desipramina a 10 mg/mL e clomipramina a 4 mg/mL
em água.
Equipamentos
Cromatógrafo a gás HP 6890 com injetor “split/
splitless” e detetor de nitrogênio e fósforo. Integrador HP
3395 (Hewlett-Packard, Wilmington, EUA). Coluna capi-
lar HP-Ultra 2 (5% de polimetilsiloxano), de 25m X 0,32
mm X 0,17 mm (Hewlett-Packard, Little Falls, EUA).
Reagentes
Metanol, isopropanol e n-hexano grau LiChrosolv®
(Merck), sulfato de sódio anidro P.A. (Merck), hidróxido
de amônio 25% P.A. (Merck) e cloreto de amônio P.A.
(Merck).
Amostras
Para desenvolver os estudos de validação do método
foi utilizada mistura de soro de voluntários que não fizeram
uso de imipramina ou clomipramina, usada como amostra
de referência negativa “branco”. Alíquotas de amostras
“branco” adicionados de imipramina e desipramina na faixa
de concentração de 50 a 500 ng/mL a serem utilizadas como
material de referência nos estudos de padronização e vali-
dação do método. Amostra de soro de paciente sob terapia
antidepressiva com imipramina (25 mg/dia). As amostras
foram colhidas após aprovação do Comitê de Ética em Pes-
quisa da FCF-USP.
Procedimento de extração
As amostras foram submetidas ao seguinte procedi-
mento de extração: 1 mL de soro contendo 100 mL de p.I.
(clomipramina a 4mg/mL) adicionado de 0,5 mL de tam-
pão amônia pH 11 após agitação em vórtex por 5 segun-
dos, foi extraído com 5 mL de n-hexano/isopropanol
(99,5:0,5) em agitador mecânico por 20 minutos. A fase
orgânica foi transferida para tubo contendo 50 mg de
Na2SO4 anidro e em seguida para outro tubo de evapora-
ção. O extrato foi evaporado sob N2 e o resíduo retomado
em 100 mL de metanol e 1 mL injetado no CG.
Condições cromatográficas
Condições cromatográficas: Injetor 260 OC com razão
de divisão de 1:20; temperatura inicial do forno 190 OC por
8 min, aquecimento 20 OC/min até 210 OC mantido por dois
min, aquecimento 20 OC/min até 250 OC mantido por um
min; detetor 280 OC, fluxos de H2, ar sintético e gás auxiliar
(hélio) total de 3, 60 e 10 mL/min, respectivamente. Gás de
arraste (hélio) 2,6 mL/min e corrente na pérola 20 pA.
Padronização de método utilizando a cromatografia a gás para determinação... 323
Validação do método
Especificidade
O estudo da especificidade foi feito injetando-se
padrões de fármacos com índices de retenção próximos ao
da imipramina, desipramina e p.I. e que podem ser pres-
critos comumente a indivíduos deprimidos. Adicional-
mente foram feitas algumas análises de amostras conside-
radas “branco”.
Linearidade
Foram construídas curvas de calibração com amostras
adicionadas com quantidades crescentes de imipramina e
desipramina de 50 a 500 ng/mL e p.I. a 400 ng/mL submeti-
das ao procedimento de extração e análise cromatográfica.
Todas as amostras adicionadas foram analisadas em
triplicata. A linearidade do detetor foi estudada na faixa de
concentração de 100 ng/mL a 10 mg/mL para imipramina e
desipramina. A linearidade das curvas foi avaliada por meio
das equações da reta e coeficientes de determinação (r2).Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção foram determinados através
da extração, injeção e quantificação de nove replicatas de
adicionados de imipramina e desipramina nas concentra-
ções de 50, 40 30 e 15 ng/mL. Foi considerado como limi-
te de detecção a menor concentração em que todas as
replicatas apresentassem picos que pudessem ser integra-
dos nas condições padronizadas.
Os limites de quantificação foram determinados
pela quantificação de nove replicatas de adicionados de
imipramina e desipramina nas concentrações de 50, 40, 30
e 25 ng/mL. Foi considerado como limite de quantificação
a menor concentração em que o coeficiente de variação
não excedeu 10%.
Precisões intra e interensaio
A precisão intra-ensaio foi determinada por meio da
extração de nove replicatas de adicionados nas concentra-
ções de 50, 200 e 500 ng/mL. A precisão foi calculada
indiretamente, por meio da medida da imprecisão dada
pelo coeficiente de variação das áreas relativas.
A precisão interensaio foi determinada por meio da
imprecisão dada pelo coeficiente de variação das áreas
relativas de triplicatas de adicionados de imipramina e
desipramina nas concentrações de 50, 200 e 500 ng/mL
submetidos ao procedimento de extração durante seis dias.
Recuperações absoluta e relativa
A recuperação absoluta foi calculada por meio da
comparação das áreas relativas de amostras adicionadas
de imipramina e desipramina nas concentrações de 50,
200 e 500 ng/mL e p.I. na concentração de 400 ng/mL,
submetidos ao procedimento de extração proposto, com as
áreas relativas de amostras adicionadas nas mesmas con-
dições anteriores, mas com imipramina e desipramina
adicionadas após a extração.
A recuperação relativa foi calculada comparando-se
a relação entre as áreas relativas de padrões de imipramina
e desipramina adicionados em amostras de soro nas con-
centrações de 50, 200 e 500 ng/mL e p.I. na concentração
de 400 ng/mL, submetidos ao procedimento de extração
proposto, com as áreas relativas obtidas pela injeção de
adicionados em metanol contendo imipramina, desipra-
mina e p.I., que não foram submetidas ao procedimento de
extração. Foram avaliadas seis replicatas de cada adicio-
nado em dois dias diferentes.
Exatidão
A avaliação da exatidão do método foi procedida
pela quantificação de triplicatas de amostras de soro adi-
cionadas nas concentrações de 50, 200 e 500 ng/mL. A
partir das concentrações encontradas foi calculada a por-
centagem de inexatidão.
Estabilidade
A estabilidade foi avaliada pela quantificação de
imipramina e desipramina adicionadas em soro nas con-
centrações de 50, 200 e 500 ng/mL, armazenadas em re-
frigerador (4 OC) e em congelador (-20 OC), sendo calcu-
lada por meio do aumento da inexatidão em análises rea-
lizadas após uma e duas semanas. Foram consideradas
estáveis as amostras que após quantificação apresentaram
inexatidão inferior a 10%.
RESULTADOS
A análise cromatográfica dos padrões de
imipramina, desipramina e padrão interno na coluna e
condições padronizadas foi considerada satisfatória quan-
to ao tempo de análise e perfil cromatográfico (Figura 1).
Especificidade
A Figura 2 mostra a capacidade de resolução da
coluna na separação de mistura de padrões de imipramina,
A. C. Araujo, R. C. Pedroso324
FIGURA 3 - Cromatograma de extrato de soro “branco”, nas condições padronizadas.
FIGURA 2 - Cromatograma obtido da mistura de padrões de imipramina (6,985 min), desipramina (7,450 min) e
clomipramina (10,501 min), juntamente com padrões de fármacos com potencial de interferência na análise, sendo:
amitriptilina (6,394), nortriptilina (6,752), biperideno (8,080), prometazina (8,180), carbamazepina (8,853), diazepam
(11,071) e clorpromazina (11,785).
FIGURA 1 - Cromatograma obtido por injeção da mistura de padrões de imipramina, desipramina e p.I., que nas
condições padronizadas eluiram com tempos de retenção de 7,056, 7,530 e 10,587 min respectivamente.
desipramina e clomipramina juntamente com padrões de
fármacos potencialmente interferentes na análise. A Figu-
ra 3 mostra cromatograma de extrato obtido por meio de
soro “branco”, em que pode ser verificada a ausência de
picos interferentes.
Padronização de método utilizando a cromatografia a gás para determinação... 325
TABELA I - Precisão intra e interensaios da imipramina e desipramina estimadas indiretamente pelos valores de desvio
padrão (D.P.) e coeficiente de variação (C.V.)
Precisão intraensaio Precisão interensaio
Concentração imipramina desipramina imipramina desipramina
ng/mL D.P. C.V. (%) D.P. C.V. (%) D.P. C.V. (%) D.P. C.V. (%)
 50 0,012 8,3 0,009 6,9 0,008 6,2 0,008 6,3
200 0,024 5,0 0,043 8,8 0,022 4,6 0,040 8,9
500 0,071 5,9 0,058 5,0 0,040 3,3 0,073 6,0
TABELA II - Resultado do estudo das recuperações absoluta e relativa da imipramina e desipramina
Recuperação absoluta Recuperação relativa
Concentração imipramina desipramina imipramina desipramina
(ng/mL) (%) (%) (%) (%)
50 71,2 (±18,0) 75,7 (±4,1) 93,5 (±6,2) 99,9 (±5,4)
200 84,2 (±4,2) 71,0 (±4,4) 87,2 (±3,6) 88,6 (±3,9)
500 65,7 (±2,7) 65,1 (±7,2) 89,9 (±2,9) 81,5 (± 4,3)
Linearidade
As equações da reta e coeficientes de determinação
(r2) foram y = 0,0024x + 0,0097 com r2 de 0,9998 para a
imipramina e y = 0,0023x + 0,0185 com r2 de 0,9999 para
a desipramina.
Limites de detecção e quantificação
Nas condições padronizadas, os limites de detecção
foram 15 e 20 ng/mL para imipramina e desipramina, res-
pectivamente, nas amostras de soro adicionadas. Da mes-
ma forma, os limites de quantificação foram de 25 ng/mL
para imipramina e 40 ng/mL para desipramina.
Precisões intra e interensaio
A Tabela I apresenta, respectivamente, as precisões
intra e interensaio para imipramina e desipramina nas
condições padronizadas.
Recuperações absoluta e relativa
A Tabela II mostra as recuperações absoluta e rela-
tiva para imipramina e desipramina.
Exatidão
A exatidão do método proposto, calculada indireta-
mente através da inexatidão é apresentada na TABELA
III.
Estabilidade
Os analitos foram considerados estáveis por uma
semana, tanto em refrigerador (4 OC) quanto em congela-
dor (-20 OC).
TABELA III - Porcentagem de inexatidão do método
proposto, em estudo com amostras adicionadas de
imipramina e desipramina
Inexatidão do método
Concentração Imipramina Desipramina
(ng/mL) (%) (%)
50 13,2 (±0,008) 7,5 (±0,008)
200 -0,04 (±0,006) -10,25 (±0,006)
500 -2,72 (±0,0298) 5,98 (±0,0524)
A. C. Araujo, R. C. Pedroso326
FIGURA 5 - Cromatograma do extrato de amostra de paciente idoso em terapia com imipramina 25 mg/dia. As
concentrações obtidas foram de 30,4 ng/mL para a imipramina (7,062) e 43,3 ng/mL para a desipramina (7,539),
respectivamente.
FIGURA 4 - Cromatograma de extrato de amostra de soro adicionada com imipramina (7,043) e desipramina (7,515)
a 100 ng/mL e p.I. (10,579) a 400 ng/mL.
Amostras
A Figura 4 mostra cromatograma de extrato obtido
de amostra adicionada e a Figura 5 apresenta
cromatograma de extrato obtido de amostra de paciente
em terapia com 25 mg de imipramina.
DISCUSSÃO
A especificidade do método mostrou-se adequada.
Foram testados alguns fármacos com potencial para inter-
ferência e, ao final, imipramina, desipramina e p.I. foram
separados satisfatoriamente, tanto entre si como de inter-
ferentes endógenos e exógenos. O método demonstrou
linearidade adequada, abrangendo desde concentrações
sub-terapêuticas até tóxicas. Além disto, a precisão, limi-
tes de detecção e quantificação e recuperação foram
satisfatórias. A exatidão está de acordo com o objetivo do
trabalho, e foi testada com amostras de adicionados de
imipramina e desipramina em soro, preparadas no próprio
laboratório, devido à dificuldade na obtenção de amostras
certificadas. A estabilidade dos fármacos no soro, testada
com adicionados mantidos em freezer e geladeira, foi de
duas semanas para imipramina, mas para desipramina
apenas uma semana. Assim, a estabilidade da amostra foi
considerada de uma semana, estando adequada ao objeti-
vo da monitorização terapêutica,mas menor que a ob-
servada por Orsulak et al.(1984), de quatro semanas. A
análise de soro de um paciente com uso de imipramina (25
mg/dia) deu resultado positivo para imipramina e
desipramina, sem a presença de interferentes. Esta dosa-
gem de imipramina (25 mg/dia) proporcionou no pacien-
Padronização de método utilizando a cromatografia a gás para determinação... 327
te concentrações sub-terapêuticas tanto de imipramina
(30,4 ng/mL) quanto de desipramina (43,3 ng/mL), o que
mostra que o método é capaz de quantificar imipramina e
desipramina em pacientes que utilizam baixas dosagens.
Concluindo, o método proposto demonstrou ser aplicável
na monitorização terapêutica de imipramina
ABSTRACT
Standardization of method using gas
chromatography for the quantification of
imipramine and desipramine in sample of serum for
therapeutic drug monitoring
Tricyclic antidepressants are efficient, have accessible
price and, despite of its side effect, are still utilized for
depression treatment. In this work a methodology to
quantification of imipramine and desipramine in serum
samples using the gas chromatography with capillary
column and nitrogen-phosphorous detector was
developed with purpose of therapeutic drug monitoring. In
the standard conditions imipramine, desipramine and
internal standard (clomipramine) were eluted with
retention time of 7,043, 7,515, 10,579 min respectively.
The linearity of methodology in the concentration range
from 50 to 500 ng/mL showed determination coefficients
of 0,9998 for imipramine and 0,9999 for desipramine. The
coefficients of variation of 6,4% (±0,036) and 4,7%
(±0,023) for imipramine and 6,9% (±0,037) and
7,1%(±0,039) for desipramine were obtained in of intra-
assay and inter-assay precision studies, respectively.
Detection limits of 15 ng/mL for imipramine and 20 ng/mL
for desipramine, and quantification limits of 25 ng/mL for
imipramine and 40ng/mL for desipramine were obtained
in added samples. The absolute recovery was of 73,7% for
imipramine and 70,6% for desipramine and the relative
recovery was 90% for both. The inaccuracy was 5,32%
and 7,91% for imipramine and desipramine respectively.
The stability of the drugs in serum was one week.
UNITERMS: Depression. Imipramine. Desipramine.
Therapeutic drug monitoring. Gas chromatography.
Nitrogen-phosphorous detector.
AGRADECIMENTOS
Clínica Antônio Luiz Sayão de onde foi obtida a
amostra de paciente idoso.
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Recebido para publicação em 20 de setembro de 2000.