Aula - HPLC

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04/06/2013
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Cromatografia
Definição da IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry):
Cromatografia é um método físico de 
separação no qual os componentes da 
amostra a serem separados distribuem-se 
entre duas fases: uma fase estacionária 
(parada) e uma fase móvel, que flui em 
uma direção definida
Pure and Applied Chemistry 65(4) (1993) 819-872
Cromatografia
� Em uma visão moderna, o que é cromatografia?
�Adição da amostra em uma fase móvel (eluente) e 
a sua entrada na coluna.
�A amostra é separada em seus componentes 
enquanto passa pela coluna, geralmente após 
interagir com uma fase estacionária. 
�O eluente (ou fase móvel) então elui da coluna.
�O eluente (agora contendo analitos separados em 
bandas) é normalmente passado por um detector 
para análise quantitativa. Se a cromatografia é 
usada para propósitos de purificação, o eluente 
também pode ser coletado. 
Coluna 
empacotada
Amostra Fase móvel
Cromatograma mostrando o sinal do detector 
nos vários estágios da eluição
Classificação geral Método específico Fase estacionária Tipo de equilíbrio
1. Cromatografia a 
gás (CG)
a. Gás-líquido
Líquido adsorvido 
ou ligado a uma 
superfície sólida
Partição entre gás 
e líquido
b. Gás –sólido
Sólido
Adsorção
2. Cromatografia a 
líquido (CL)
a. Líquido-líquido 
ou partição
Líquido adsorvido 
ou ligado a uma 
superfície sólida
Partição entre 
líquidos imiscíveis
b. Líquido-sólido ou 
adsorção
Sólido Adsorção
c. Troca iônica
Resina de troca 
iônica
Troca iônica
d. Exclusão por 
tamanho
Líquido nos 
interstícios de um 
sólido polimérico
Partição/exclusão
Classificação dos métodos cromatográficos em coluna Tipos de cromatografia
� Adsorção: adsorção dos analitos na superfície de uma fase 
estacionária sólida. São adsorvidos na fase estacionária
� Partição: partição dos analitos em um filme líquido ligado 
às partículas da fase estacionária. São absorvidos na fase 
estacionária.
� Troca iônica: Atração eletrostática dos íons a um grupo 
funcional carregado eletricamente da fase estacionária. 
� Exclusão de tamanho (ou exclusão molecular): habilidade 
das moléculas dos analitos em percorrer caminhos 
diferentes na fase estacionária. 
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ABsorção x ADsorção
Absorção Adsorção
Cromatografia e Cromatograma
� A cromatografia é o método analítico instrumental, o 
cromatograma é o registro !!! Cromatograma é um 
gráfico do sinal versus tempo após a injeção. 
� Separação cromatográfica é um processo no qual 
analitos permanecem mais ou menos tempo 
(dependendo de quanto eles se assemelham com a fase 
estacionária. Aqueles que permanecem mais tempo na 
fase estacionária, elui mais tarde. Aqueles que 
permanecem menos tempo elui mais rapidamente. 
� A diferença nesses tempos (que dependem de uma série 
de equilíbrios) determina a ordem de eluição. 
phase stationary(eluent) phase mobile Analyte Analyte ↔Analitos fase móvel Analitos fase estacionária
Perfis de concentração das bandas dos solutos A e B em 
dois tempos diferentes de suas migrações através da coluna 
Distância de migração
C
on
ce
n
tr
a
çã
o
Terminologia da Cromatografia
� tm= tempo para eluir um analito não retido (apenas a 
fase móvel); chamado de tempo morto ou vazio. 
� tr= tempo de retenção: tempo que o analito gasta para 
eluir na coluna após a injeção; tempo total gasto na 
coluna.
� tr’(ou ts) = tempo de retenção ajustado: Tr – Tm ; tempo 
que o analito permanece na fase estacionária. 
Tempo
Si
n
a
l d
o 
de
te
ct
or
Si
n
a
l d
o 
de
te
ct
or
octano desconhecido nonano
tempo
Tempo 
injeçãoRe
sp
o
st
a 
do
 
de
te
ct
o
r
Migração dos solutos
�Constante de distribuição (Kc):
� Constante de equilíbrio para a distribuição dos 
soluto A entre as duas fases (estacionária e móvel). 
� Assim, para diferentes analitos, a diferença entre 
os valores de Kc fornece uma indicação das 
diferenças dos seus tempos de retenção.
móvel
iaestacionár
c
móvel
iaestacionár
c
iaestacionár
K
móvel
 [A]
[A]
= K 
 A Atividade
A Atividade
 = K
AA c→←
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Outros Termos (existem muitos outros)
� Velocidade linear média da fase móvel
� Velocidade linear média dos solutos
Esses termos podem ser relacionados com a 
constante de distribuição, o volume da coluna, etc. 
mt
(L) coluna da ntoempacotame do ocompriment
 = µ
rt
(L) coluna da ntoempacotame do ocompriment
 = υ
Fator de Retenção (k)
� Relação do tempo que o analito gasta na fase 
estacionária e o tempo que o mesmo gasta na fase 
móvel. Valores maiores de k significam que o analito 
permanece mais tempo na fase estacionária. 
m
sr
m
mr
A
m
sA
A
t
)(ou t t
 = 
t
 t- t
 = k
phases. stationary and mobile theof columes theare V and
A""for constant on distributi theisK where
V
VK
 = k
′
, onde KA é a constante de distribuição e 
Vs e Vm são os volumes das duas fases 
(estacionária e móvel) 
Parâmetro experimental importante usado para comparar 
as velocidades de migração dos solutos nas colunas.
Fator de retenção ou capacidade (k’): velocidade de 
migração do soluto na coluna � O fator de seletividade é a relação entre os 
fatores de retenção para diferentes analitos 
na mesma amostra. 
, onde B é o soluto retido mais fortemente e A e 
o soluto retido mais fracamente.
� α é sempre maior do que a unidade ( >1).
� Assim, se α = 1, não houve separação 
(coeluição).
� um valor de α maior significa uma melhor 
separação entre os picos.
A para )(ou t t
B para )(ou t t
 = 
k
k
 = 
K
K
 = 
sr
sr
A
B
A
B
′
′
α
Fator de seletividade (αααα) 
Fator de separação ou seletividade:
velocidades diferentes de migração
Teoria do prato na cromatografia
� “Número de pratos teóricos” relaciona a largura do 
pico cromatográfico ou a velocidade de migração das 
moléculas do soluto em uma coluna. Quanto mais 
pratos, a “largura” do pico é mais estreita e a 
probabilidade dos picos vizinhos serem separados é 
maior ... 
� Também, se uma coluna é considerada um tubo, uma 
porção do tubo (uma seção transversal) pode ser 
considerada um prato. Quanto menor em altura cada 
prato, maior o número de pratos na coluna! 
� Assim, número de pratos (N) e altura do prato teórico 
(H)) são termos usados como medidas quantitativas da 
eficiência da coluna cromatográfica.
� Mais pratos = uma melhor separação.
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Perfil do analito
ao final da coluna
Entrada da amostra
Empacotamento
Distância de migração
onde σ está relacionado com a largura do pico
L
=H
H=N
2
altura de um prato teórico
comprimento da coluna
no de pratos teóricos
σ
Definição de altura do prato: H = σ2/L
O número de pratos explica a forma Gaussiana do pico 
cromatográfico e as velocidades de migração das 
moléculas do soluto através da coluna.
Altura do prato pode ser considerada como o 
comprimento da coluna que contém uma fração do 
analito que está entre L e L- σ
n
o
de
 
m
o
lé
cu
la
s
Tempo ou volume
Ponto de inflexão 
(ponto mais 
inclinado da 
curva)
injeção
Re
sp
o
st
a 
do
 
de
te
ct
o
r
Determinação experimental do número de pratos
� Comparações entre analitos em uma dada coluna. 
� Para aumentar o número de pratos teóricos (N), 
pode-se diminuir a altura do prato (H) ou aumentar 
o comprimento da coluna: N = L/H
2
r
W
t
 16 = N 





Eficiência da coluna: vazão da fase móvel
�Se o comprimento da coluna for 
constante, pode-se aumentar N ao 
diminuir H. 
�Existe uma vazão da fase móvel ótima 
(eluente) que permite que os solutos 
permaneçam em equilíbrio nas duas 
fases em qualquer coluna, e essa é uma 
maneira de minimizar H.
Variáveis que influenciam 
na eficiência da coluna
Alargamento da banda - perda de
eficiência da coluna.
... Quanto menor as velocidades dos processos de 
transferência de massa que ocorrem durante a 
migração do soluto através da coluna, maior será 
o alargamento da banda na saída da coluna.
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�Velocidade linear da fase móvel (µ)
�Coeficiente de difusão na fase móvel (Dm)
�Coeficientede difusão na fase estacionária (Ds)
�Fator de retenção (k)
�Diâmetro das partículas do recheio (dp)
�Espessura do filme líquido que recobre o suporte (df)
(cont.) Variáveis que influenciam 
na eficiência da coluna
Efeito da vazão da fase 
móvel na altura de prato 
para (a) CL e (b) CG. 
Observe a grande 
diferença entre as escalas 
de vazão e altura de 
pratos.
Cromatografia a líquido
Vazão da fase móvel, cm/s
Cromatografia gás-líquidoCromatografia a gás
Vazão da fase móvel, cm/s
Teoria do alargamento dos picos e a 
equação de van Deemter.
�H é a altura do prato, em cm.
�B/µ se refere a difusão longitudinal.
�Csµ é o termo de transferência de 
massa para a fase estacionária.
�Cmµ é o termo de transferência 
de massa para a fase móvel.
 
H = B
µ
 + Csµ + CMµ
� Difusão longitudinal (B/µ) - difusão de um soluto em 
um solvente. Solutos tendem a migrar de uma 
região mais concentrada para uma região menos 
concentrada. 
� Tempo de equilíbrio - quanto maior o tempo de 
residência do analito na coluna, mais equilíbrios 
existirão entre a fase estacionária e a fase móvel. 
Resultado: a banda tende a se espalhar devido ao 
fato que nem todas as etapas de equilíbrio usam 
exatamente o mesmo tempo ...
� Caminhos múltiplos - algumas moléculas 
atravessam a coluna por caminhos diferentes 
(coluna empacotada). Tempos de residência na 
coluna podem diferir...
Variáveis cinéticas que afetam o alargamento das bandas
Direção 
do fluxo
Caminhos 
típicos de duas 
moléculas 
durante a eluição
Formato do pico - Gaussiano
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Como um pico se move ao 
longo da coluna ……..
perfil da concentração
coluna
início
Velocidade linear da fase móvel, µ, cm/s
Contribuição dos vários coeficientes de 
transferência de massa para a altura de 
prato de uma coluna 
C
o
n
tr
ib
u
iç
ão
 
pa
ra
 
H
, 
cm
Resolução de uma coluna
�Fornece uma medida quantitativa da 
capacidade de uma coluna em separar 
dois analitos.
�Mostra quanto duas bandas se distanciam 
uma em relação à outra levando em 
consideração as suas larguras.
�Quanto maior a resolução = melhor é a 
separação
� Quanto mais tempo o analito está na coluna, maior é o 
alargamento da banda. “Corridas” mais curtas limitam o 
alargamento da banda. 
Resolução de uma coluna:
habilidade de separar dois analitos
Rs =
∆∆∆∆ tR
Wm
W1 + W2Wm=
2
Obs.: Tr e W - mesma unidade
Tempo, min
Si
n
a
l d
o
 
de
te
ct
o
r
. 
)
Bk 1
Bk)(1-( 
4
N
 = R 
2
BW
 
2
AW
r t
 = R
+
+
∆
α
α
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Problema geral de eluição
Tempo
Si
n
a
l d
et
ec
to
r
Tempo de retenção, min
In
jeç
ão
In
jeç
ão
In
jeç
ão
In
jeç
ão
In
jeç
ão
40% metanol/
60% água
50% metanol/
50% água
60% metanol/
40% água
70% metanol/
30% água
Sobrecarga de amostra (cauda e assimetria frontal)
Tailing = stationary 
phase degradation...
Tempo
Cauda
diminui
aumenta
Tempo
Sobrecarga
S
in
a
l
S
in
a
l
Tempo
Distorções dos picos = variação da constante 
de distribuição com a concentração 
1) A figura abaixo mostra problemas de resolução diferentes em 
uma determinada separação: (a), (b) e (c), que exigem estratégias
de separação diferentes. Quais dos três parâmetros k’, N, e α
deveria ser alterado para produzir a resolução desejada em 
cada caso? 
Justifique.
Exercício no1
Resolução do exercício no1
(a) Os tempos de retenção são muito curtos, isto é, os dois 
valores de k’ são muito baixos (k’2 < 1), de modo que k’2
precisa ser aumentado para que esteja dentro da faixa ótima.
(b) Aqui k’2 está dentro da faixa ótima (k’2 ≈ 5) mas a resolução 
é insuficiente. A melhor solução será um aumento em N.
(a) Embora k’ está de novo ótimo (k’ ≈ 5), a resolução é muito 
pequena e seria necessário um aumento muito grande em N
para obter uma separação. Isso resultaria em tempos de 
retenção muito longos. Seria melhor mudar a fase estacionária 
e/ou a fase móvel para aumentar α nesse caso. 
Exercício no 2
As substâncias A e B têm tempos de retenção de
16,40 min e 17, 30 min, respectivamente, em uma
coluna de 30,0 cm. Um composto não retido
passa através da coluna em 1,30 min. As larguras
do pico na linha de base para A e B são 1,11 min
e 1,21 min, respectivamente.
Calcule (a) resolução da coluna, (b) no médio de
pratos na coluna, (c) altura de prato e (d)
comprimento da coluna necessário para se obter
uma resolução de 1,5.
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(a) Rs = 2(17,63 - 16,40)/(1,11 + 1,21) = 1,06
(b) N = 16 (16,40/1,11)2 = 3493 e 
N = 16 (17,63/1,21)2 = 3397
N médio = (3493 + 3397)/2 = 3445 = 3,4 x 103
(c) H = L/N = 30,0/3445 = 8,7 x 10-3 cm
(d) k’ e α não variam muito com o aumento de N e L. 
Assim, substituindo N1 e N2 na equação:
Resolução do exercício no 2 
. 
)
Bk 1
Bk)(1-( 
4
N
 = R 
2
BW
 
2
AW
r t
 = R
+
+
∆
α
α
(cont. Exercício no 2) 
e dividindo uma das equações resultantes pela outra:
(Rs)1/(Rs)2 = √N1/ √N2 , 
onde 1 e 2 se referem a coluna original e a coluna mais 
comprida, respectivamente. Substituindo os valores 
apropriados para N1, (Rs)1, e (Rs)2, tem-se:
1,06/1,5 = √3445/ √N2 
N2 = 3445 (1,5/1,06)2 = 6,9 x 103
mas 
L = N/H = 6,9 x 103 x 8,7 x 10-3 = 60 cm