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04/06/2013 1 Cromatografia Definição da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): Cromatografia é um método físico de separação no qual os componentes da amostra a serem separados distribuem-se entre duas fases: uma fase estacionária (parada) e uma fase móvel, que flui em uma direção definida Pure and Applied Chemistry 65(4) (1993) 819-872 Cromatografia � Em uma visão moderna, o que é cromatografia? �Adição da amostra em uma fase móvel (eluente) e a sua entrada na coluna. �A amostra é separada em seus componentes enquanto passa pela coluna, geralmente após interagir com uma fase estacionária. �O eluente (ou fase móvel) então elui da coluna. �O eluente (agora contendo analitos separados em bandas) é normalmente passado por um detector para análise quantitativa. Se a cromatografia é usada para propósitos de purificação, o eluente também pode ser coletado. Coluna empacotada Amostra Fase móvel Cromatograma mostrando o sinal do detector nos vários estágios da eluição Classificação geral Método específico Fase estacionária Tipo de equilíbrio 1. Cromatografia a gás (CG) a. Gás-líquido Líquido adsorvido ou ligado a uma superfície sólida Partição entre gás e líquido b. Gás –sólido Sólido Adsorção 2. Cromatografia a líquido (CL) a. Líquido-líquido ou partição Líquido adsorvido ou ligado a uma superfície sólida Partição entre líquidos imiscíveis b. Líquido-sólido ou adsorção Sólido Adsorção c. Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica d. Exclusão por tamanho Líquido nos interstícios de um sólido polimérico Partição/exclusão Classificação dos métodos cromatográficos em coluna Tipos de cromatografia � Adsorção: adsorção dos analitos na superfície de uma fase estacionária sólida. São adsorvidos na fase estacionária � Partição: partição dos analitos em um filme líquido ligado às partículas da fase estacionária. São absorvidos na fase estacionária. � Troca iônica: Atração eletrostática dos íons a um grupo funcional carregado eletricamente da fase estacionária. � Exclusão de tamanho (ou exclusão molecular): habilidade das moléculas dos analitos em percorrer caminhos diferentes na fase estacionária. 04/06/2013 2 ABsorção x ADsorção Absorção Adsorção Cromatografia e Cromatograma � A cromatografia é o método analítico instrumental, o cromatograma é o registro !!! Cromatograma é um gráfico do sinal versus tempo após a injeção. � Separação cromatográfica é um processo no qual analitos permanecem mais ou menos tempo (dependendo de quanto eles se assemelham com a fase estacionária. Aqueles que permanecem mais tempo na fase estacionária, elui mais tarde. Aqueles que permanecem menos tempo elui mais rapidamente. � A diferença nesses tempos (que dependem de uma série de equilíbrios) determina a ordem de eluição. phase stationary(eluent) phase mobile Analyte Analyte ↔Analitos fase móvel Analitos fase estacionária Perfis de concentração das bandas dos solutos A e B em dois tempos diferentes de suas migrações através da coluna Distância de migração C on ce n tr a çã o Terminologia da Cromatografia � tm= tempo para eluir um analito não retido (apenas a fase móvel); chamado de tempo morto ou vazio. � tr= tempo de retenção: tempo que o analito gasta para eluir na coluna após a injeção; tempo total gasto na coluna. � tr’(ou ts) = tempo de retenção ajustado: Tr – Tm ; tempo que o analito permanece na fase estacionária. Tempo Si n a l d o de te ct or Si n a l d o de te ct or octano desconhecido nonano tempo Tempo injeçãoRe sp o st a do de te ct o r Migração dos solutos �Constante de distribuição (Kc): � Constante de equilíbrio para a distribuição dos soluto A entre as duas fases (estacionária e móvel). � Assim, para diferentes analitos, a diferença entre os valores de Kc fornece uma indicação das diferenças dos seus tempos de retenção. móvel iaestacionár c móvel iaestacionár c iaestacionár K móvel [A] [A] = K A Atividade A Atividade = K AA c→← 04/06/2013 3 Outros Termos (existem muitos outros) � Velocidade linear média da fase móvel � Velocidade linear média dos solutos Esses termos podem ser relacionados com a constante de distribuição, o volume da coluna, etc. mt (L) coluna da ntoempacotame do ocompriment = µ rt (L) coluna da ntoempacotame do ocompriment = υ Fator de Retenção (k) � Relação do tempo que o analito gasta na fase estacionária e o tempo que o mesmo gasta na fase móvel. Valores maiores de k significam que o analito permanece mais tempo na fase estacionária. m sr m mr A m sA A t )(ou t t = t t- t = k phases. stationary and mobile theof columes theare V and A""for constant on distributi theisK where V VK = k ′ , onde KA é a constante de distribuição e Vs e Vm são os volumes das duas fases (estacionária e móvel) Parâmetro experimental importante usado para comparar as velocidades de migração dos solutos nas colunas. Fator de retenção ou capacidade (k’): velocidade de migração do soluto na coluna � O fator de seletividade é a relação entre os fatores de retenção para diferentes analitos na mesma amostra. , onde B é o soluto retido mais fortemente e A e o soluto retido mais fracamente. � α é sempre maior do que a unidade ( >1). � Assim, se α = 1, não houve separação (coeluição). � um valor de α maior significa uma melhor separação entre os picos. A para )(ou t t B para )(ou t t = k k = K K = sr sr A B A B ′ ′ α Fator de seletividade (αααα) Fator de separação ou seletividade: velocidades diferentes de migração Teoria do prato na cromatografia � “Número de pratos teóricos” relaciona a largura do pico cromatográfico ou a velocidade de migração das moléculas do soluto em uma coluna. Quanto mais pratos, a “largura” do pico é mais estreita e a probabilidade dos picos vizinhos serem separados é maior ... � Também, se uma coluna é considerada um tubo, uma porção do tubo (uma seção transversal) pode ser considerada um prato. Quanto menor em altura cada prato, maior o número de pratos na coluna! � Assim, número de pratos (N) e altura do prato teórico (H)) são termos usados como medidas quantitativas da eficiência da coluna cromatográfica. � Mais pratos = uma melhor separação. 04/06/2013 4 Perfil do analito ao final da coluna Entrada da amostra Empacotamento Distância de migração onde σ está relacionado com a largura do pico L =H H=N 2 altura de um prato teórico comprimento da coluna no de pratos teóricos σ Definição de altura do prato: H = σ2/L O número de pratos explica a forma Gaussiana do pico cromatográfico e as velocidades de migração das moléculas do soluto através da coluna. Altura do prato pode ser considerada como o comprimento da coluna que contém uma fração do analito que está entre L e L- σ n o de m o lé cu la s Tempo ou volume Ponto de inflexão (ponto mais inclinado da curva) injeção Re sp o st a do de te ct o r Determinação experimental do número de pratos � Comparações entre analitos em uma dada coluna. � Para aumentar o número de pratos teóricos (N), pode-se diminuir a altura do prato (H) ou aumentar o comprimento da coluna: N = L/H 2 r W t 16 = N Eficiência da coluna: vazão da fase móvel �Se o comprimento da coluna for constante, pode-se aumentar N ao diminuir H. �Existe uma vazão da fase móvel ótima (eluente) que permite que os solutos permaneçam em equilíbrio nas duas fases em qualquer coluna, e essa é uma maneira de minimizar H. Variáveis que influenciam na eficiência da coluna Alargamento da banda - perda de eficiência da coluna. ... Quanto menor as velocidades dos processos de transferência de massa que ocorrem durante a migração do soluto através da coluna, maior será o alargamento da banda na saída da coluna. 04/06/2013 5 �Velocidade linear da fase móvel (µ) �Coeficiente de difusão na fase móvel (Dm) �Coeficientede difusão na fase estacionária (Ds) �Fator de retenção (k) �Diâmetro das partículas do recheio (dp) �Espessura do filme líquido que recobre o suporte (df) (cont.) Variáveis que influenciam na eficiência da coluna Efeito da vazão da fase móvel na altura de prato para (a) CL e (b) CG. Observe a grande diferença entre as escalas de vazão e altura de pratos. Cromatografia a líquido Vazão da fase móvel, cm/s Cromatografia gás-líquidoCromatografia a gás Vazão da fase móvel, cm/s Teoria do alargamento dos picos e a equação de van Deemter. �H é a altura do prato, em cm. �B/µ se refere a difusão longitudinal. �Csµ é o termo de transferência de massa para a fase estacionária. �Cmµ é o termo de transferência de massa para a fase móvel. H = B µ + Csµ + CMµ � Difusão longitudinal (B/µ) - difusão de um soluto em um solvente. Solutos tendem a migrar de uma região mais concentrada para uma região menos concentrada. � Tempo de equilíbrio - quanto maior o tempo de residência do analito na coluna, mais equilíbrios existirão entre a fase estacionária e a fase móvel. Resultado: a banda tende a se espalhar devido ao fato que nem todas as etapas de equilíbrio usam exatamente o mesmo tempo ... � Caminhos múltiplos - algumas moléculas atravessam a coluna por caminhos diferentes (coluna empacotada). Tempos de residência na coluna podem diferir... Variáveis cinéticas que afetam o alargamento das bandas Direção do fluxo Caminhos típicos de duas moléculas durante a eluição Formato do pico - Gaussiano 04/06/2013 6 Como um pico se move ao longo da coluna …….. perfil da concentração coluna início Velocidade linear da fase móvel, µ, cm/s Contribuição dos vários coeficientes de transferência de massa para a altura de prato de uma coluna C o n tr ib u iç ão pa ra H , cm Resolução de uma coluna �Fornece uma medida quantitativa da capacidade de uma coluna em separar dois analitos. �Mostra quanto duas bandas se distanciam uma em relação à outra levando em consideração as suas larguras. �Quanto maior a resolução = melhor é a separação � Quanto mais tempo o analito está na coluna, maior é o alargamento da banda. “Corridas” mais curtas limitam o alargamento da banda. Resolução de uma coluna: habilidade de separar dois analitos Rs = ∆∆∆∆ tR Wm W1 + W2Wm= 2 Obs.: Tr e W - mesma unidade Tempo, min Si n a l d o de te ct o r . ) Bk 1 Bk)(1-( 4 N = R 2 BW 2 AW r t = R + + ∆ α α 04/06/2013 7 Problema geral de eluição Tempo Si n a l d et ec to r Tempo de retenção, min In jeç ão In jeç ão In jeç ão In jeç ão In jeç ão 40% metanol/ 60% água 50% metanol/ 50% água 60% metanol/ 40% água 70% metanol/ 30% água Sobrecarga de amostra (cauda e assimetria frontal) Tailing = stationary phase degradation... Tempo Cauda diminui aumenta Tempo Sobrecarga S in a l S in a l Tempo Distorções dos picos = variação da constante de distribuição com a concentração 1) A figura abaixo mostra problemas de resolução diferentes em uma determinada separação: (a), (b) e (c), que exigem estratégias de separação diferentes. Quais dos três parâmetros k’, N, e α deveria ser alterado para produzir a resolução desejada em cada caso? Justifique. Exercício no1 Resolução do exercício no1 (a) Os tempos de retenção são muito curtos, isto é, os dois valores de k’ são muito baixos (k’2 < 1), de modo que k’2 precisa ser aumentado para que esteja dentro da faixa ótima. (b) Aqui k’2 está dentro da faixa ótima (k’2 ≈ 5) mas a resolução é insuficiente. A melhor solução será um aumento em N. (a) Embora k’ está de novo ótimo (k’ ≈ 5), a resolução é muito pequena e seria necessário um aumento muito grande em N para obter uma separação. Isso resultaria em tempos de retenção muito longos. Seria melhor mudar a fase estacionária e/ou a fase móvel para aumentar α nesse caso. Exercício no 2 As substâncias A e B têm tempos de retenção de 16,40 min e 17, 30 min, respectivamente, em uma coluna de 30,0 cm. Um composto não retido passa através da coluna em 1,30 min. As larguras do pico na linha de base para A e B são 1,11 min e 1,21 min, respectivamente. Calcule (a) resolução da coluna, (b) no médio de pratos na coluna, (c) altura de prato e (d) comprimento da coluna necessário para se obter uma resolução de 1,5. 04/06/2013 8 (a) Rs = 2(17,63 - 16,40)/(1,11 + 1,21) = 1,06 (b) N = 16 (16,40/1,11)2 = 3493 e N = 16 (17,63/1,21)2 = 3397 N médio = (3493 + 3397)/2 = 3445 = 3,4 x 103 (c) H = L/N = 30,0/3445 = 8,7 x 10-3 cm (d) k’ e α não variam muito com o aumento de N e L. Assim, substituindo N1 e N2 na equação: Resolução do exercício no 2 . ) Bk 1 Bk)(1-( 4 N = R 2 BW 2 AW r t = R + + ∆ α α (cont. Exercício no 2) e dividindo uma das equações resultantes pela outra: (Rs)1/(Rs)2 = √N1/ √N2 , onde 1 e 2 se referem a coluna original e a coluna mais comprida, respectivamente. Substituindo os valores apropriados para N1, (Rs)1, e (Rs)2, tem-se: 1,06/1,5 = √3445/ √N2 N2 = 3445 (1,5/1,06)2 = 6,9 x 103 mas L = N/H = 6,9 x 103 x 8,7 x 10-3 = 60 cm
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