PCR

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PCR 
Reação em Cadeia da Polimerase 
Atua e ajuda: na realização 
de Exames laboratoriais 
 identificar e quantificar 
substâncias e agentes patogênicos 
BIOLOGIA MOLECULAR 
A Sorologia sempre funciona ? 
 Infecções fulminantes por vírus, infecções 
com risco de evolução maligna necessitam 
de um diagnóstico precoce 
 Sangue 
 Urina 
 Outros fluidos corporais 
 Bulbo capilar 
 Cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de 
parafina). 
Quais AMOSTRAS usar? 
Surgimento da PCR 
Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em Química (1993) 
pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, 
em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um 
determinado fragmento de DNA. 
 
Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA 
 Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic 
amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis 
of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54 
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-
catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35 
a técnica e vendeu para a empresa Karl Mullis (1987) – Patenteou 
Hoffmann-La Roche em 1991. 
Quais foram as limitações? 
 Síntese de oligonucleotídeos (primers) 
 
 Purificação de DNA polimerase 
Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cópia de segmentos 
específicos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na 
utilização de uma DNA polimerase termoestável. 
 
Fig. 1: Kary Mullis, inventor da 
PCR, em foto de 1994 
(Nobel Academy) 
Mullis 
Taq DNA polimerase 
Thermus 
aquaticus 
P e r m i t e 
mudança na 
temperatura 
Primer 
Especificidade da reação 
Mimetizar a replicação do DNA em regiões específicas do genoma 
São pequenas sequências de oligonucleotídeos 
DNA 
molde 
Primer 
 
Especificidade da Reação 
Primers 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
3. TAQ POLIMERASE 
Thermus aquaticus 
Thermus 
acquaticus 
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol. 98, No. I 
 
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile 
 
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE 
 
Department of Microbiology, Indiana University, Bloomington, Indiana 47401 
 
The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful enrichment 
requires incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient media relatively dilute with respect to the organic components. 
Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of thermal springs in Yellowstone National Park and from a thermal 
spring in California. The organism has also been isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap water, in 
geographical locations quite distant from thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative nonsporulating nonmotile 
rods which frequently form long filaments at supraoptimal temperatures or in the stationary phase. The optimum temperature 
for growth is 70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C. The generation time at the optimum is about 50 min. 
PCR 
DNA 
Aquecer 
Inserir os Primers 
Sintetize da fita de DNA 
1. Desnaturação 
2. Anelamento 
3. Extensão 
Etapas 
Anelamento 
37°C - 65°C 
Extensão 
72°C 
25-35 
ciclos 
Desnaturação 
93°C - 95°C 
Desnaturação 
93°C - 95°C 
 Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase) 
 
 Reação enzimática de polimerização de DNA in vitro 
 
 É uma reação cíclica na qual os produtos de um ciclo são substratos 
para o ciclo seguinte 
 
 Amplificação de sequências específicas de DNA, permitindo sua 
visualização e/ou análise posterior 
 
 É um processo termodinâmico e enzimático 
PCR 
Reação para amplificação de segmento 
específico de DNA 
 Exon especifico de um gene humano 
Quais são as aplicações da PCR? 
 Diagnósticos moleculares 
 Identificação e isolamento de genes 
 Marcadores moleculares 
 Expressão gênica 
Aplicações 
 Teste de 
Identificação de 
indivíduos 
 
 polimorfismo 
Elementos da PCR 
DNA amostra, DNA polimerase, Termociclador – substitui a 
helicase e dNTPs – nucleotídeos trifosfatados 
Elementos da PCR 
(dNTPs) 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
Sequência 
alvo 
Sequência 
alvo 
1. MOLDE DE DNA 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
2. PRIMERS DE DNA – 2 (“SENSE” E “ANTI-SENSE”) 
ATTCCAGAGC 
CGTCAATGGT 
5’ 3’ TAAGGTCTCG 
5’ 3’ GCAGTTACCA 
prim
er 
prim
er 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
3. TAQ POLIMERASE 
Thermus 
aquaticus 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
4. NUCLEOTÍDEOS 
dAT
P 
dTTP 
dCT
P 
dGT
P 
PCR – Reação em Cadeia da 
Polimerase 
5. TERMOCICLADOR 
Bloco 
aqueci
do 
Painel de 
controle 
microtu
bos 
Ciclos de PCR 
Temp 
(oC) 
tempo 
90oC 
50-60oC 
70oC 
Temperatura de 
desnaturação 
Temperatura de 
anelamento 
Temperatura 
de extensão 
Ciclos de PCR 
ATTCCAGAGC 
CGTCAATGGT 
90oC 
CGTCAATGGT 
ATTCCAGAGC 
Ciclos de PCR 
CGTCAATGGT 
ATTCCAGAGC 
50-
60oC 
CGTCAATGGT 
ATTCCAGAGC 
5’ 3’ GCAGTTACCA 
5’ TAAGGTCTCG 3’ 
Ciclos de PCR 
CGTCAATGGT 
ATTCCAGAGC 
5’ 3’ GCAGTTACCA 
5’ TAAGGTCTCG 3’ 
CGTCAATGGT 
ATTCCAGAGC 
5’ 3’ GCAGTTACCA 
5’ TAAGGTCTCG 3’ 
70oC 
Ciclos de PCR 
Ciclos de PCR 
Termocicladores 
Amplificação Exponencial 
Ao sair do 
termociclador 
a aparência é 
a mesma – 
revelação da 
região 
amplificada 
http://teach.genetics.utah.edu
/ 
Eletroforese 
Eletroforese 
Interpretando os Resultados 
Trabalhando com PCR 
convencional 1. Etapas Pré- PCR: 
Coleta da Amostra 
Estabilização 
Extração do Ácido 
Nucleico 
2. PCR ou Ciclagem: 
Preparo da Reação 
Termociclagem 
3. Pós-PCR: 
Análise em Gel