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1 O Mundo Microbiano 2 3 Sumário Aspectos citomorfológicos microbianos Histórico da Microbiologia Morfologia bacteriana Citologia e fisiologia Ação bacteriana Controle microbiano Agentes físicos Agentes químicos Fatores de virulência Resistência microbiana e mecanismos Microbactérias patógenas Cocos Gram-positivos Neisseria Enterobactérias Bacilos não fermentadores Bacilos espiralados ou curvos Bacilos Gram-positivos Bactérias anaeróbicas restritas Microbiota normal Microbiota específica em cada região Pele CLIQUE NO CAPÍTULO PARA SER REDIRECIONADO 6 7 9 11 19 20 23 24 25 26 32 33 36 38 40 42 43 45 50 51 51 4 Sumário Boca e vias aéreas Trato intestinal Uretra e vagina Olho Referências CLIQUE NO CAPÍTULO PARA SER REDIRECIONADO 51 52 54 57 58 5 Objetivos Definição Explicando Melhor Você Sabia? Acesse Resumindo Nota Importante Saiba Mais Reflita Atividades Testando Para o início do desenvolvimento de uma nova competência; Se houver necessidade de se apresentar um novo conceito; Algo precisa ser melhor explicado ou detalhado; Curiosidades indagações lúdicas sobre o tema em estudo, se forma necessárias; Se for preciso acessar um ou mais sites para fazer download, assistir vídeos, ler textos, ouvir podcast; Quando for preciso se fazer um resumo acumulativo das últimas abordagens; Quando forem necessárias observações ou complementações para o seu conhecimento; As observações escritas tiveram que ser priorizadas para você; Textos, referências bibliográficas e links para aprofundamento do seu conhecimento; Se houver a necessidade de chamar a atenção sobre algo a ser refletido ou discutido sobre; Quando alguma atividade de autoaprendizagem for aplicada; Quando o desenvolvimento de uma competência for concluído e questões forem explicadas. 6 @faculdadelibano_ 1 Aspectos citomorfológicos microbianos 7 O Mundo Microbiano Capitulo 1 Aspectos citomorfológicos microbianos Histórico da Microbiologia Os principais microrganismos estudados na Microbiologia são bactérias, fungos, algas e protozoários, os quais podem provocar infecções. Existem diversas formas de identificação e diagnóstico desses microrganismos. Mas, para que seja possível identificá-los, é necessário entender sua estrutura, morfologia, fisiologia, reprodução e metabolismo. Apesar de a maioria deles ser vista apenas microscopica- mente, eles possuem características comuns aos sistemas bio- lógicos, capacidade de se reproduzir, de ingerir substâncias, de excretar metabólitos e de reagir a alterações no ambiente, sendo susceptíveis a mutações. Objetivos Durante o capítulo, você irá mergulhar no histórico dos microrganismos, desvendando as suas prin- cipais características. A compreensão desta etapa inicial é extremamente importante para o enten- dimento da Microbiologia. E então? Motivado para desenvolver essa competência? Então vamos lá. Avante! Você Sabia? Os vírus, apesar de não serem considerados vivos, possuem algumas características de células vivas e por isso são estudados como microrganismos. 8 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Roger Bacon, no século XIII, sugeriu que as doenças fossem causadas por seres vivos “invisíveis” e, desde então, os estudos na Microbiologia têm avançado. Foram necessários muitos esforços de químicos e biólogos para provar que as bactérias, como todos os organismos vivos, surgiam de outros organismos semelhantes. Louis Pasteur (1822-1895) e Robert Koch (1843-1910) iniciaram a era da Bacteriologia após estabelecerem esse fato. Durante os anos de 1880 e 1900, foram descobertas várias bactérias patogênicas, além de terem sido desenvolvidas técnicas de coloração e fixação utilizadas até hoje. Depois dos trabalhos de Pasteur, Friedrich Gustav Jacob Henle (1809-1885) postulou suas ideias, que mostravam condições básicas para que um agente microscópico pudesse ser considerado causador de alguma doença infecciosa ou contagiosa, são os “Postulados de Henle”. FIGURA 1 Exemplo de vírus FONTE Freepik 9 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Mais tarde, esses postulados foram aperfeiçoados e correspondem a: • “Um microrganismo pode sempre ser encontrado em associação com uma dada doença.” • “O organismo pode ser isolado e cultivado, em cultura pura, no laboratório.” • “A cultura pura produzirá a doença quando inoculada em animal sensível.” • “É possível recuperar o microrganismo, em cultura pura, dos animais experimentalmente infectados.” Morfologia bacteriana A unidade de medida das bactérias é o micrômetro (mm). Muitas bactérias medem de 2 a 6 mm de comprimento e 1 a 2 mm de largura. As bactérias podem se apresentar em três tipos morfológicos: bastonetes/bacilos, cocos e espirilos. Os bastonetes podem ser curtos ou longos com extremidade, podendo esta ser reta ou de ponta arredondada ou curva (forma de vírgula). Os espirilos têm forma de hélice, espiralar. Os cocos podem ser esféricos, com formato de ponta de lança, e podem formar diferentes arranjos (a depender de sua divisão celular, se foi em plano único ou em mais planos). Acesse Conheça mais sobre a vida e o trabalho de Louis Pasteur assistindo ao vídeo da Verve Científica, que se aprofunda na grande influência desse cientista para a evolução de vários campos da Bacteriologia. Clique aqui. https://www.youtube.com/watch?v=HDSxiQnzkOQ 10 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Quando os cocos estão agrupados de dois em dois, são chamados de diplococos. Quando vários cocos estão agrupados em cadeia (divisão em único plano), são chamados estreptococos. Quando os cocos estão agrupados de forma aleatória, semelhante a um cacho de uva, são chamados de estafilococos. FIGURA 2 Tipos de bactérias FONTE Freepik Nota Os bastonetes não possuem tantos arranjos como os cocos e, na maioria das vezes, estão isolados. Entretanto, podem se apresentar em pares (diplo- bacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). 11 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Quando os bastonetes são muito curtos, são chamados cocobacilos. Os espirilos estão, na maioria das vezes, isolados. As tétrades e sarcinas são agrupamentos de quatro e oito cocos, respectivamente. Citologia e fisiologia As bactérias são seres procariotos, ou seja, não possuem carioteca e são mais simples em relação à sua estrutura quando comparadas aos seres eucariotos. As células procariotas possuem estruturas fundamentais à sua viabilidade, que são o genoma, o ribossomo, a parede e a membrana celular, além de estruturas acessórias, que conferem características adicionais à célula, como flagelo, pili, cápsula, plasmídeo, endósporo ou grânulo de inclusão. A parede celular é responsável pela rigidez, divisão celular e manutenção osmótica, também faz parte da proteção mecânica da célula e é responsável pelas reações tintoriais. É formada, principalmente, por um complexo macromolecular, conhecido como muco complexo (também chamado de peptidoglicano, mureína, mucopeptídio ou glicopeptídio). Acesse Assista ao vídeo do Mundo Microscópico, que irá auxiliar você no entendimento da morfologia bacteriana, mostrando cada um dos principais formatos das bactérias, entre elas as que estudamos até aqui. Acesse o QR code ou Clique aqui. https://www.youtube.com/watch?v=byV9NiOIoNo&pp=ygUUTXVuZG8gTWljcm9zY8OzcGljbyA%3D 12 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Nas bactérias Gram-negativas, a parede celular está composta por uma camada de peptidoglicano e três outros componentes que a envolvem externamente (lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo). As bactérias Gram-positivas possuem como característica os ácidos teicoicos, e os lipídios estão em maior quantidade e muito ligados entre si. Existem algumas bactérias chamadasmicoplasmas, que não possuem parede celular nem peptidoglicano, ou seja, são incapazes de corar pelo método de Gram. FIGURA 3 Morfologia bacteriana FONTE Adobe Stock. 13 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 A parede celular das arqueobactérias também não possui a mesma estrutura das bactérias comuns, podendo apresentar uma parede rígida ou uma simples camada S (geralmente glicoproteínas). O ribossomo é formado por duas subunidades, está disperso no citoplasma e a sua função é a síntese proteica. A estrutura do seu genoma é a fita de DNA circular e possui função de armazenar as informações genéticas. Os flagelos são organelas responsáveis pela locomoção. Uma célula bacteriana pode possuir de um a vários flagelos de acordo com a sua espécie. Importante O gênero da bactéria Mycobacterium possui uma parede celular atípica e é o exemplo mais importante de microrganismo que, devido ao caráter hidrofóbico de sua parede, sua coloração pelo método de Gram é dificultada. Nota As bactérias Gram-negativas são constituídas por uma endotoxina, o lipopolissacarídeo (LPS) – que é responsável pela propriedade de patogenicidade –, enquanto nas bactérias Gram-positivas a exotoxina, composta pelo ácido lipoteicoico, tem como característica principal a aderência. Essas bactérias, como fatores de ataque ou agressão, caracterizam-se por graus diferentes de virulência. 14 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 O pili, ou pelos, são apêndices curtos e retilíneos, comuns em bactérias Gram-negativas e possuem função de aderir a locais específicos e de conjugação bacteriana. O pili sexual serve para ligar duas bactérias e permitir a troca de plasmídeo. O plasmídeo é uma estrutura de DNA extracromossomial e confere várias vantagens seletivas, como a resistência a antibióticos. Os esporos formam-se quando o meio se torna inadequado à sobrevivência da bactéria em sua forma vegetativa, fazendo que se mantenha em forma esporulada/latente por tempos, até que o meio se torne viável novamente para a sua forma vegetativa. A constituição molecular da bactéria não é muito diferente de seres eucariotos, sua arquitetura é formada por diferentes macromoléculas, constituídas por distintas unidades. As células bacterianas são formadas a partir de nutrientes, que são transformados nos constituintes celulares e também podem ser utilizados para liberar energia para a célula. FIGURA 4 Ribossomo FONTE Freepik 15 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Existem diversos macronutrientes, como oxigênio, carbono e cálcio, e micronutrientes, como zinco e cobre, além dos fatores de crescimento, que são compostos orgânicos requeridos em pequenas quantidades por algumas bactérias que não podem sintetizá- los, e os três grupos principais são aminoácidos, purinas/pirimidinas e vitaminas. O metabolismo é constituído pelo anabolismo e pelo catabolismo, e vai ser catalisado por sistemas integrados de enzimas que medeiam reações que necessitam de energia. As formas de obtenção de energia das bactérias são através da respiração aeróbica e anaeróbica ou através da fermentação. O crescimento microbiano diz respeito ao aumento do número de células, fazendo que se acumulem em colônias, e a sua visualização é possível sem uso do microscópio. Existem algumas condições necessárias para o crescimento microbiano, como água, macro e micronutrientes, fatores de crescimento, temperatura, pH, pressão osmótica e oxigênio. Nota Todos esses nutrientes e fatores, quando são adquiridos, fazem a bactéria absorvê-los e transformá-los para que exerçam suas funções importantes para o metabolismo bacteriano. Você Sabia? Você Sabia? As bactérias usam energia para transporte de nutrientes, para movimentação dos seus flagelos e para realizar biossíntese. 16 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Existem fases no crescimento bacteriano, a fase Lag (latência) corresponde à fase da adaptação da bactéria ao meio; a fase Log (exponencial) corresponde ao crescimento exponencial bacteriano; a fase estacionária corresponde à parada no crescimento bacteriano devido à multiplicação de algumas bactérias e morte de outras por causa da produção de toxinas; por fim, a fase de decaimento, que corresponde à fase em que ocorre morte de muitas bactérias devido à escassez de nutrientes no meio. O ciclo celular bacteriano ocorre por meio da reprodução assexuada ou sexuada. A reprodução assexuada pode ser por fissão binária (bipartição), em que ocorre a divisão da célula-mãe em duas células idênticas; fragmentação, em que as bactérias filamentosas liberam filamentos que dão origem a uma nova bactéria; por brotamento, semelhante às leveduras, em que se forma um broto que dá origem a uma nova bactéria; ou por esporogenia, em que ocorre a formação de novas bactérias pela formação de esporos. Já a reprodução sexuada ocorre por conjugação, que exige o contato entre as células e transporte de material genético por plasmídeo (pili sexual). FIGURA 5 Curva do crescimento bacteriano FONTE Brainly (2018, on-line). 17 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 FIGURA 6 Ciclo reprodutivo bacteriano FONTE Santos (2022, on-line). Saiba Mais Quer se aprofundar nesse tema? Recomendamos o acesso à seguinte fonte de consulta e aprofundamento: Caderno: “Técnico em Alimentos: Micro- biologia Básica“ (CARVALHO, 2010). Acesse clicando aqui. https://ifpr.edu.br/pronatec/wp-content/uploads/sites/46/2013/06/Microbiologia_Basica.pdf 18 O Mundo Microbiano Aspectos citomorfológicos microbianos Capitulo 1 Resumindo E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo, vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter visto que a Microbiologia é uma área extensa, que abrange diferentes microrganismos e que cada um desses microrganismos possui características únicas. Aprendeu, primeiramente, um pouco sobre como tudo começou, os primeiros cientistas que desvendaram os aspectos microbianos. Compreendeu que as bactérias são microrganismos que possuem características celulares diferentes das de seres eucariotos, tanto em sua morfologia como citologia, fisiologia e reprodução. Viu que as bactérias possuem diversos formatos que podem ser visualizados por meio de técnicas de coloração, como a coloração de Gram (que será abordada mais detalhadamente em outro capítulo). Você aprendeu um pouco sobre tudo isso, porque alguns assuntos abordados após esta unidade dependerão do entendimento deste capítulo. 19 @faculdadelibano_ 2 Ação bacteriana 20 O Mundo Microbiano Capitulo 2 Ação bacteriana Compreender adequadamente os termos básicos e o con- texto do controle de microrganismos, seja por qual método for, é essencial para evitar procedimentos equivocados ou insuficientes, que possam interferir na qualidade dos procedimentos e dos produtos. Controle microbiano O controle microbiano ocorre quando há ações com o intuito de remover, matar, reduzir o número ou inibir o crescimento de microrganismos. O controle pode ser feito por meio de métodos químicos ou físicos, e, ao fazer a sua escolha, devem ser levados em consideração o agente microbiano a ser afetado e a forma como ele pode interferir. Objetivos Ao término deste capítulo, você será capaz de en- tender como ocorre o controle de microrganismos, conhecer acerca de seus fatores de virulência e os mecanismos de ação e de resistência bacteriana. E então? Motivado para conhecer todas essas ações? Então, vamos lá. Avante! Nota O método de escolha depende do tipo de material que contém o microrganismo. 21 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Como sabemos, os microrganismos podem ser bactérias, fungos, protozoários ou vírus, conseguem sobreviver e resistir a diferentes temperaturas e ambientes e são,muitas vezes, patógenos. O controle microbiano evita doenças infecciosas, atua na preservação de alimentos e também na preservação de outros produtos e materiais. Existem alguns agentes antimicrobianos que vão atuar na prevenção do crescimento desses microrganismos, que são os antibacterianos, antivirais, antifúngicos e antiprotozoários. Também existem os agentes microbicidas, utilizados para exterminar ou destruir todos os microrganismos, que são os agentes bactericidas, fungicidas e viricidas. Já os agentes microbiostáticos vão atuar inibindo o crescimento dos microrganismos, que são os agentes fungistáticos e bacteriostáticos. FIGURA 7 Limpeza e desinfecção de frutas e legumes FONTE Freepik Importante Devem ser levados em consideração a natureza do microrganismo presente, o efeito, que normalmente não é espontâneo, e o agente, que afeta diretamente o microrganismo. 22 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Para melhor compreender cada uma das formas de desinfecção e controle microbiano, é preciso entender que estas vão variar de acordo com o processo adotado para cada uma delas, de forma que destacamos: • Esterilização: forma de destruir todas as formas de micróbios por meio do calor. • Esterilização comercial: relaciona-se com a destruição específica dos esporos bacterianos conhecidos como Clostridium botulinum. • Desinfecção: nesse processo, é possível matar todas as bactérias, exceto os endósporos, de forma a auxiliar na redução da contaminação de superfícies e objetos, geralmente por meio da lavagem e do uso de produtos específicos para limpeza. • Antissepsia ou degerminação: processo relacionado à limpeza de tecidos vivos, podendo ser exemplificado com a lavagem das mãos. Nesse caso, temos o uso de substâncias desinfetantes (álcool, detergente, sabão etc.) para a remoção de bactérias de forma mecânica. • Sanitizantes: nesse caso, temos a utilização de deter- minadas substâncias para que se seja reduzido o número de microrganismos em determinados locais, até que sua presença seja segura. TABELA 1 Principais métodos de controle microbiano FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 23 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Agentes físicos Destacamos os principais agentes físicos utilizados no controle microbiano. As baixas temperaturas atuam como bacteriostático e podem ser utilizadas com base em refrigeração, congelamento rápido profundo (para conservação de culturas a 80° C) ou liofilização. TABELA 2 Principais formas de controle microbiano FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 24 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 O calor úmido, mediante fervura e autoclave, mata células vegetativas (bactérias e fungos), esporos e vírus; na pasteurização, ocorre desnaturação proteica, matando a maioria dos microrganismos patogênicos. O calor seco também pode ser utilizado, com chama direta, incineração ou esterilização com ar quente. O ressecamento (remoção de água dos microrganismos) possui um efeito bacteriostático. Também podem ser utilizados diferentes tipos de radiação que podem causar mutações, inibição de enzimas e alterações na célula. Agentes químicos Dentre os agentes químicos utilizados no controle microbiano, o fenol e os agentes fenólicos atuam como antissépticos ou desinfetantes pela ruptura da membrana plasmática e desnaturação proteica. As biguanidas possuem efeito bactericida, fungicida e não esporicida. Agentes oxidantes, como iodo e cloro, são bactericidas e fungicidas. Álcoois são antissépticos ou desinfetantes. Além desses, existem os agentes de superfície, como sabões e detergentes, que podem remover os microrganismos ou ser antimicrobianos. Os halogênios e metais pesados também podem ser usados como desinfetantes, fungicidas, bactericidas ou bacteriostáticos. Nota Existem variáveis que podem influenciar na atividade antimicrobiana desses agentes, como o tamanho da população microbiana (quanto maior a população, mais tempo levará para ser destruída), a intensidade ou concentração do agente (quanto menor, mais tempo levará para destruir), o tempo de exposição ao agente (quanto maior o tempo, maior o número de células mortas), a temperatura de exposição (temperaturas mais altas matam mais rapidamente a população), entre outras. 25 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Fatores de virulência A invasão de microrganismos pode ser facilitada por fatores de virulência, pela aderência microbiana, pela resistência aos antimicrobianos e pelos defeitos nos mecanismos de defesa do hospedeiro. As principais estratégias de virulência em bactérias são aderência, invasão, evasão das defesas do hospedeiro, produção de toxinas e captação de nutrientes. Os fatores de virulência ajudam os patógenos a invadirem e resistirem às defesas do hospedeiro, podendo ser cápsulas, enzimas ou toxinas. Alguns microrganismos possuem uma cápsula que vai bloquear a fagocitose, o que os torna mais virulentos do que os microrganismos não encapsulados. Definição A patogenicidade é a capacidade de um microrganismo causar qualquer dano em um hospedeiro, e virulência é a capacidade relativa de um microrganismo causar danos em um hospedeiro. FIGURA 8 Formas de evitar a propagação de vírus FONTE Freepik 26 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 As enzimas são proteínas bacterianas que atuam facilitando a disseminação no tecido local, fazendo que microrganismos invasivos possam penetrar e percorrer as células eucariotas, facilitando a entrada por mucosas. Alguns microrganismos podem liberar toxinas que são capazes de causar doença ou aumentar a sua gravidade. Alguns microrganismos podem se tornar mais virulentos por prejudicarem a produção de anticorpos, resistirem às etapas oxidativas na fagocitose e por produzirem superantígenos. A aderência microbiana ajuda os microrganismos a penetrar os tecidos e aderir a quase todas as células humanas. O biofilme é uma estrutura fina que pode ser formada ao redor de algumas bactérias, que faz que elas resistam à fagocitose e aos antibióticos. Resistência microbiana e mecanismos Para entender como os microrganismos conseguem ser resistentes aos processos de destruição, precisamos entender um pouco sobre o mecanismo de ação dos antibióticos, que são utilizados no combate às bactérias. Os antibióticos podem atuar de diferentes formas, são responsáveis pela inibição da síntese do peptideoglicano presente na Nota O botulismo, que é uma intoxicação alimentar, é causado por uma toxina botulínica produzida pela bactéria Clostridium botulinum. Nota Pode se desenvolver ao redor da bactéria Pseudomonas aeruginosa em pacientes com fibrose cística e ao redor de bactérias estafilococos coagulase-negativas em dispositivos médicos sintéticos (cateteres, enxertos, materiais de sutura). 27 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 parede celular da bactéria, também podem lesionar a membrana plasmática, interferir na síntese de ácidos nucleicos e proteínas ou agir em metabólitos. Os microrganismos possuem variabilidade genética que não pode ser evitada. A escolha do antimicrobiano vai ser de acordo com as cepas e sua capacidade de sobrevivência. Em 1940, o uso de antibióticos curou muitas doenças e, àquela época, não demonstrou nenhum risco às pessoas. Com o passar dos tempos e com a crescente utilização desses medicamentos, surgiram linhagens bacterianas resistentes ao tratamento. Os antibióticos são compostos químicos produzidos por microrganismos que atuam inibindo ou matando outros microrganismos. Nota As bactérias Gram-positivas serão afetadas por antibióticos tipo penicilina, que afetam a síntese do peptideoglicano. Você Sabia? O primeiro antibacteriano descoberto por Ale- xander Fleming, em 1928, foi a penicilina, que se mostrou muito eficaz durante a Segunda Guerra Mundial. 28 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 A atividade microbicida faz que haja diminuição na quantidade de células viáveise inibe o crescimento e a divisão do microrganismo sensível. Já a atividade microbiostática paralisa o metabolismo do microrganismo sensível, fazendo que o número de células viáveis fique constante durante horas. FIGURA 9 Desenvolvimento de antibióticos FONTE Freepik FIGURA 10 Comparação entre os diferentes tipos de tratamento FONTE UFJF (2013, on-line). 29 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Ao escolher o agente antimicrobiano, deve-se levar em consideração a toxicidade seletiva, ou seja, a capacidade de destruir o patógeno sem afetar o hospedeiro, não induzir resistência bacteriana, alcançar níveis bactericidas por longos períodos, ser capaz de atingir o sítio infectado e possuir um espectro de ação satisfatório (atingir bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e anaeróbicas). Os antimicrobianos podem ser usados em combinação, para aumentar o espectro e atingir um efeito letal sinérgico no tratamento de infecções polimicrobianas. A resistência aos antimicrobianos pode ser natural ou adquirida. Quando o microrganismo possui capacidade de resistir à ação do antibiótico por causa das características estruturais e funcionas, é resistência natural. Quando o microrganismo foi anteriormente sensível ao antibiótico e tornou-se resistente, é adquirida. Nota A resistência a drogas, na maioria das vezes, é carreada por plasmídeos. FIGURA 11 Transferência de genes de resistência FONTE UFJF (2013, on-line). 30 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Quando as drogas antimicrobianas são utilizadas de forma incorreta, pode ocorrer interferência nos microrganismos pre- sentes na microbiota do hospedeiro, interferindo na homeostase da microbiota normal (principalmente no intestino). Devido à grande irresponsabilidade no uso dessas drogas, a resistência microbiana tem se tornado um grande problema. Além das bactérias resistentes, surgiram bactérias multirresistentes, que possuem resistência a dois ou mais grupos de antimicrobianos. Pacientes internados em UTI, com idade avançada, com infecções recorrentes, com exposição hospitalar frequente ou imunodeficientes são os mais susceptíveis às bactérias multirresistentes. Importante Quando lançadas ou despejadas no meio ambiente, também podem interferir no equilíbrio ecológico dos microrganismos presentes. Saiba Mais Quer se aprofundar neste tema? Recomendamos a leitura do artigo Desafios do cuidar em saúde fren- te à resistência bacteriana: uma revisão (OLIVEIRA; SILVA, 2008). Acesse clicando aqui. 31 O Mundo Microbiano Ação bacteriana Capitulo 2 Resumindo E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo, vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido que existem alguns mé- todos para eliminar ou impedir o crescimento de microrganismos. Aprendeu que existem diferenças entre esses métodos, e a sua escolha irá depen- der do tipo do microrganismo e do objetivo final, podendo ser agentes físicos ou químicos. Viu que os microrganismos possuem fatores de virulência que ajudam a piorar os danos causados nos hos- pedeiros e a resistirem aos antimicrobianos. Por falar em resistência, conheceu os mecanismos que os microrganismos possuem para resistir às dro- gas antimicrobianas e também conheceu as ações dos antimicrobianos e os tipos. Por fim, você pôde compreender a importância de ter responsabili- dade ao administrar os antibióticos corretamente, que podem tornar as bactérias resistentes, seja de forma natural ou adquirida. 32 @faculdadelibano_ 3 Microbactérias patógenas 33 O Mundo Microbiano Capitulo 3 Microbactérias patógenas Existem bactérias de importância médica presentes no meio rural, em alimentos e produtos, no ar e em secreções e também podem ser transmitidas por via sexual. Cocos Gram-positivos Existem algumas bactérias cocos gram-positivas que são de importância médica, como Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. e outras. Os estafilococos são as bactérias mais resistentes ao meio ambiente, calor, e em amostras clínicas secas. Apesar de existir antimicrobianos que combatam essas bactérias, elas são extremamente importantes para as pessoas. A Staphylococcus aureus coloniza o homem na amamentação, podendo estar presente também na nasofaringe e na pele. Infecções causadas por essa bactéria algumas vezes se mostraram resistentes ao tratamento com antibiótico, mesmo os mais potentes. Objetivos O objetivo deste capítulo é apresentar as principais bactérias patogênicas, de importância médica e as infecções causadas por elas. Ao final, você terá compreendido as características únicas e o mecanismo de desenvolvimento das doenças nos hospedeiros. Vamos lá? Importante Devido a essa capacidade de se tornar resistente aos antibióticos, há a necessidade de identificação e diagnóstico rápidos para os casos dessa bactéria. 34 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 A bactéria Streptococcus spp. é capaz de provocar doenças graves, apesar de não ser mais uma causa importante em infecções hospitalares, mas requer também rápida identificação. As bactérias Enterococcus spp. são causadoras de infecções hospitalares e tornam-se resistentes a quase todos os antibióticos utilizados no tratamento da infecção. A identificação dessas bactérias pode ser por meio da morfologia que elas apresentam em meio líquido, mediante a forma em que se apresentam na placa com o meio de cultura adequado (as colônias de estafilococos são maiores, de coloração branca a amarela e convexas, e as de estreptococos são puntiformes, apresentando beta ou alfa hemólise. Mas para diferenciar esses dois tipos de bactérias, é necessário realizar a prova da catalase como confirmação). Você Sabia? As bactérias Streptococcus spp. foram as maiores causadoras de infecção hospitalar na era pré-anti-biótica, causando surtos de infecção e morte. TABELA 3 Divisão dos cocos Gram- positivos pela prova da catalase FONTE Levy (2004, p. 234). 35 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Existem aproximadamente 31 espécies de estafilococos coagulase negativa, sendo que as mais frequentes são Staphy- lococcus epidermidis, responsável por causar infecções em pró- teses e cateteres; Staphylococcus saprophyticus, responsável por causar infecção urinária em mulheres jovens; e Staphylococcus haemolyticus, que possui uma grande resistência aos antimicro- bianos. Nota O meio de cultura ágar sangue não é indicado para essa prova, pois o sangue do meio contém catalase, podendo gerar resultado falso- positivo. TABELA 4 Identificação simplificada dos cocos Gram-positivos FONTE Levy (2004, p. 234). 36 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Também são realizados outros testes – que serão mais bem abordados em outra unidade –, para identificação bacteriana, como o da DNAse, da endonucleade, do crescimento em meio ágar manitol, entre outros. Os estreptococos podem ser identificados pela cultura em meio ágar sangue, podendo apresentar hemólise beta (total), alfa (parcial, cor verde) ou gama (nenhuma). Testes de resistência a antibióticos também são realizados, como teste da bacitracina, do sulfametoxazol trimetoprim, de CAMP, entre outros. Neisseria Existem diferentes espécies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, que são analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp. e Alcaligenes spp. As N. meningitidis e N. gonorrhoeae possuem grande importância médica por causarem meningite e gonorreia. As suas espécies são, em sua maioria, diplococos Gram-negativos. A N. gonorrhoeae é sempre considerada patogênica, podendo ser transmitida por via sexual ou pelo parto. No homem, causa uretrite e está relacionada a complicações como epididimite, prostatite e estenose uretral. Pode ser isolada também na mucosa oral e anal. A N. meningitidispode causar meningite e também causar em associação outras infecções (conjuntivite, artrite, sinusite e pneumonia) e sua transmissão é através das vias aéreas. A Moraxella catarrhalis é um patógeno potente das vias aéreas, principalmente em crianças e adultos jovens. Causa com maior frequência otite, sinusite e pneumonia, e raramente pode causar endocardite e meningite. A maioria de suas cepas são produtoras de betalactamase, e são detectadas com teste do Nitrocefin. Nota Com exceção da Neisseria elongata e Kingella deni- trificans, todas as neisserias são oxidase positivas e catalase positivas. 37 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Para identificação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae, pode se fazer o diagnóstico utilizando-se aspectos clínicos associados à bacterioscopia positiva (Diplococos Gram- negativos intracelulares) em pacientes de risco, em que a prevalência da gonorreia é significativa. Na ocorrência de surtos de meningite meningocócica, o diagnóstico presuntivo para fins de tratamento também pode se basear na clínica e na bacterioscopia do liquor ou de lesões. Nota Deve-se sempre colher material para cultura, para que seja possível confirmar e monitorar a resistência dessas bactérias. 38 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Enterobactérias Constituem 27 gêneros/102 espécies/8 grupos indefinidos da maior família e mais heterogênea de bactérias Gram- negativas patogênicas. São bacilos não esporulados, com motilidade variável, oxidase negativos, que crescem em diversos meios, são anaeróbios facultativos, fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos e reduzem nitrato a nitrito. A maioria dessas bactérias é encontrada no trato gastrointestinal de humanos, mas também pode ser encontrada em animais, na água, no solo e nos vegetais. TABELA 5 Provas de rotina para diferenciação de neisserias FONTE ANVISA (2004, p. 13). 39 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 São responsáveis por grande parte das infecções urinárias e das septicemias. As principais enterobactérias causadoras de infecções hospitalares são Escherichia coli, Klebsiella spp. e Enterobacter spp. e as principais causadoras de infecções na comunidade são Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp. e Shigella spp. As principais provas a serem feitas para identificar as enterobactérias são: fermentação da glicose e da lactose, teste de motilidade, teste de citrato, descarboxilação da lisina, produção de sulfeto de hidrogênio, produção de gás (CO2), teste da oxidase, produção de indol, de uréase, de fenilalanina desaminase ou opção triptofanase, de gelatinase ou opção DNAse. Também pode ser feita a identificação sorológica, na qual as amostras relacionadas bioquimicamente são divididas em subgrupos, por critério sorológico, de acordo com a presença dos antígenos: somático (O), flagelar (H) e de envoltório ou cápsula (K). Definição Os sorotipos são divisões baseadas no relacionamento antigênico, enquanto os biotipos são amostras do mesmo sorotipo que diferem em características bioquímicas. Nota Em atividades de rotina, a identificação sorológica é feita apenas com germes comprovadamente patogênicos e de importância epidemiológica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli ou Yersina enterocolitica. 40 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Bacilos não fermentadores Os bacilos Gram-negativos não fermentadores (BNFs) são não esporulados, aeróbicos e incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia por meio de fermentação. A sua incidência em hospitais é menor quando comparada a de outras bactérias. Entretanto, elas possuem grande resistência aos antibióticos e causam infecções graves, principalmente em pacientes graves oriundos de terapia intensiva, submetidos a procedimentos invasivos, em unidades de queimados ou com infecções do trato respiratório, como fibrose cística. São consideradas bactérias oportunistas. Os testes para identificação dessas bactérias são: teste de citrato, disco de oxidase, disco de PYR, DNAse, Mac Conkey, tubo de caldo indol, com arginina, com lisina, com gelatina, entre outros. A Pseudomonas aeruginosa é a bactéria que mais infecta pacientes com fibrose cística e juntamente com a Acinetobacter baumannii estão entre as bactérias mais isoladas em hemoculturas e amostras do trato respiratório de pacientes internados em hospitais. Os outros BNFs representam um pequeno percentual de isolados, porém, alguns apresentam resistência alta a diversos antimicrobianos, sendo capazes de causar infecções graves. FIGURA 1 Carteira de trabalho FONTE Freepik TABELA 6 BNFs de importância médica FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 41 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Você Sabia? A prevalência de BNFs no trato respiratório de pacientes portadores de fibrose cística, tais como Complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomo- nas maltophilia e Achromobacter xylosoxidans, tem aumentado nos últimos anos. TABELA 6 Identificação e descrição dos BNFs FONTE Anvisa (2008, on-line). 42 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Bacilos espiralados ou curvos Os bacilos espiralados ou curvos não são tão comuns, porém, representam grande importância médica. A tabela que se segue resume algumas bactérias e as suas respectivas doenças, formas de transmissão e o reservatório. TABELA 7 Principais bactérias curvas/espiraladas FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 43 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 A cólera é causada pelo Vibrio cholerae, produtor de toxina, e é responsável por diarreia secretória disseminada por via fecal-oral em surtos e epidemias associadas à falta de condições sanitárias adequadas. Algumas espécies de Vibrios necessitam de NaCl para crescimento. Os testes realizados para identificação dos bacilos curvos ou espiralados são: prova da catalase, teste de meio Mac Conkey, teste de ácido nalidixico, teste de cefalotina, entre outros. Bacilos Gram-positivos Quanto aos bacilos gram-positivos (BGPs), podemos dividi-los em bactérias corineformes, bacilos gram-positivos regulares, esporulados e bacilos ramificados. TABELA 8 Principais doenças associadas aos BGPs FONTE Levy (2004, on-line). 44 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Os testes iniciais a serem feitos com os BGPs são: prova da catalase, da hemólise, da resistência ao álcool-ácido, presença de esporos. O gênero Corynebacterium possui cerca de 50 espécies de algum interesse médico, os testes de diferenciação que podem ser utilizados são: redução de nitrato, prova da catalase, reação de CAMP, prova da uréase, resistência ao álcool-ácido, entre outros. As bactérias de importância médica são as espécies de C. diphtheriae e C. ulcerans, que podem produzir a toxina diftérica. Outra espécie de importância em infecções hospitalares e frequentemente isolada em material clínico é a C. jeikeium. A difteria caracteriza-se por um processo infeccioso localizado no trato respiratório e por manifestações tóxicas no coração e nervos periféricos. Arcanobacterium haemolyticum e S. pyogenes são considerados agentes patogênicos na orofaringe. Estão associados com infecções de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite. A Gardnerella spp. faz parte da microbiota vaginal de muitas mulheres em idade reprodutiva, mas está associada à vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal substituindo o Lactobacillus de Doderlein. Os Bacillus spp. encontram-se em diversos lugares, como solo, água, na matéria orgânica animal e vegetal, além de estarem presentes em condições variadas de temperatura, umidade e pH. As duas espécies mais importantes são o B. antrhacis e B. cereus. O Bacillus cereus pode causar intoxicações caracterizadas por diarreia e dor abdominal ou por náuseas e vômitos. Nota Os corineformessão um grupo heterogêneo de bactérias com poucas características em comum e também morfologicamente muito diferentes. São exemplos as bactérias Arcanobacterium spp., Corynebacterium spp., Gardnerella vaginalis, Oerskovia spp., Rhotia spp. 45 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 O Bacillus antrhacis possui três formas, antrhax cutâneo, intestinal ou pulmonar, sendo que a forma cutânea não tratada pode ser fatal e as formas pulmonares e intestinais são mais graves pela dificuldade de diagnóstico. Bactérias anaeróbicas restritas Esse grupo de bactérias é caracterizado por produzir patologia no ser humano, sem conseguir se multiplicar na presença do oxigênio. São diferentes das bactérias anaeróbicas facultativas, que possuem a capacidade de se desenvolver e se multiplicar na presença ou ausência de oxigênio. Existem algumas teorias que explicam essa ação deletéria do oxigênio nelas, como o oxigênio ser tóxico para elas ou alterar enzimas importantes no metabolismo, ou essas bactérias não possuírem enzimas como catalase, o que impede a formação de muitos peróxidos e superóxido dismutase. Você Sabia? B. antrhacis foi a primeira bactéria associada a uma doença, em 1877, por Robert Koch. O nome anthracis significa “carvão”, referenciando- se às lesões que provoca na pele, quando a infeção é cutânea. Essa bactéria possui risco elevado na comunidade quando é utilizada como arma biológica. 46 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 FIGURA 14 Microbiota do sistema digestivo FONTE Freepik Nota As partes do corpo mais expostas ao ambiente (pele e mucosas) sofrem mais rapidamente colonização por diversos microrganismos. 47 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 FIGURA 14 Principais bactérias da microbiota do sistema digestivo FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 48 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 Existem alguns fatores que podem modificar a microbiota humana, seja a idade ou até mesmo uma dieta alimentícia. A figura a seguir mostra alguns deles. A microbiota intestinal é influenciada por muitas particularidades do estilo de vida moderno, como melhoria do saneamento básico, urbanização, uso excessivo de antibióticos, menor exposição a infeções na infância, vacinação ou sedentarismo. FIGURA 13 Representação dos fatores que afetam a composição da microbiota FONTE Freepik 49 O Mundo Microbiano Microbactérias patógenas Capitulo 3 O uso de antibióticos, embora seja necessário em casos de infeção, pode ter efeitos drásticos na microbiota, como eliminar a diversidade de microrganismos e a desregular o sistema imuno- lógico do hospedeiro, aumentando a susceptibilidade à doença. Isso porque os antibióticos são, em sua maioria, de amplo espectro, ou seja, atingem não só as bactérias causadoras da infecção. Existem dois tipos de microbiota: a residente e a transitória. A microbiota residente corresponde aos microrganismos encontrados regularmente em determinada idade e região, e pode ser reconstituída facilmente. A microbiota transitória corresponde aos microrganismos que são eliminados por mecanismos naturais de defesa ou por ações de limpeza. Algumas bactérias são oportunistas, como a Clostridium difficile, e, quando a população de “competidores” é diminuída ou em pacientes imunodeprimidos, podem se multiplicar em excesso causando infecções. Importante Se a microbiota permanente estiver intacta, a microbiota transitória não causará danos e será eliminada. Mas, se os microrganismos permanentes estiverem desequilibrados, a microbiota transitória pode tornar-se patógena. Microrganismos de uma região também podem se tornar patógenos se estiverem em outro local que não seja o habitual. Definição Disbiose é o desequilíbrio na microbiota associado a doenças. 50 @faculdadelibano_ 4 Microbiota normal 51 O Mundo Microbiano Capitulo 4 Microbiota normal Microbiota específica em cada região FIGURA 15 Microbiota humana FONTE Freepik Pele Na pele, a microbiota encontra-se por toda a extensão, bem definida e constante, com microrganismos transitórios, sendo mais concentrada em regiões mais quentes e úmidas, como axilas e períneo. Geralmente predominam as bactérias Gram-positivas, como Staphylococcus, Corynebacterium e Propionobacterium. Boca e vias aéreas No nascimento, as mucosas dessas regiões são quase sempre estéreis (podem ser contaminadas no parto). Na cavidade bucal, orofaringe e nasofaringe, podem ser encontrados Streptococcus, Lactobacillus, Fusobacterium, Velionella, Neisseria, Treponema, Candida, Staphylococcus, Mycoplasma, entre outras bactérias. 52 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 A microbiota da cavidade oral tem grande importância devido às doenças periodontais (e até endocardites subagudas) serem causadas nela por microrganismos. Nas fossas nasais, predominam as bactérias Corynebacterium e Staphylococcusas, sendo as vias aéreas inferiores regiões estéreis. Trato intestinal No nascimento, o trato intestinal está estéril e os microrganismos serão introduzidos pelos alimentos. Os recém-nascidos são amamentados pelo leite materno, formado por compostos de microrganismos aeróbicos e anaeróbicos, Gram- positivos, em destaque os estreptococos e lactobacilos. A microbiota da criança será de acordo com a microbiota fecal da mãe quando o parto é natural, ou de acordo com as bactérias hospitalares em contato durante a cesariana, fazendo que a criança adquira outras bactérias mais tardiamente. Você Sabia? Quando o recém-nascido é amamentado com leite materno, ele possui maior concentração de estafilococos e bifidobactérias, e menor quantidade de clostrídeos e enterococos quando comparado a crianças amamentadas com mamadeira, que tendem a ter uma microbiota mista, com menos lactobacilos. 53 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 FIGURA 16 Microbiota intestinal FONTE Freepik O esôfago contém uma microbiota proveniente da saliva e dos alimentos, já o estômago possui poucos microrganismos (como Lactobacillus, Streptococcus spp. (produtoras de ácido láctico) e Helicobacter pylori (causadora de gastrites e úlceras) devido ao seu pH ácido, que protege contra infecções de patógenos entéricos. O cólon possui a maior parte de sua microbiota composta por bactérias anaeróbicas. O intestino grosso é o local de maior concentração de microrganismos e com grandes quantidades de bactérias anaeróbicas, predominando as bactérias Eubacterium, Bifidobacterium e Bacterióides. A flora intestinal realiza algumas ações para garantir as suas próprias características, a E. coli inibe o crescimento de algumas bactérias por meio da competição por fontes de carbono; os lactobacilos competem com outras bactérias pelos sítios de adesão e também produzem substâncias que inibem o crescimento de outros microrganismos na microbiota; as bactérias facultativas criam condições de anaerobiose e isso faz que aumente o número de bactérias anaeróbicas. Importante Todos os seres humanos são portadores da E. coli nessa microbiota. 54 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 FIGURA 17 Boas e más bactérias da microbiota intestinal FONTE Freepik A microbiota intestinal é muito importante e deve estar sempre em equilíbrio com o organismo. Ela pode influenciar beneficamente o corpo e prevenir até mesmo o câncer de cólon. Uretra e vagina Na uretra anterior, tanto do homem quanto da mulher, existem microrganismos provenientes da pele e do períneo, e eles aparecem regularmente quando a urina é eliminada. A vagina é composta de lactobacilos desde o nascimento e pode conter uma flora mista com cocos e bacilos em algumas situações (puberdade, menopausa, puerpério). 55 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 FIGURA 18 Evolução da microbiota feminina FONTE Biocodex (2022, on-line). Assim como existe a disbiose intestinal, temos também a disbiose vaginal, caracterizada por: • Perdas anormais.• Odores anormais. • Comichão. • Dores vulvares. 56 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 No caso desta, existem fatores de risco que podem aumentar a propensão da mulher em desenvolver tal desequilíbrio, sendo estes, principalmente: o estresse, baixas no sistema imunológico, péssimo estilo de vida (consumo exagerado de remédios, bebidas alcóolicas, fumo, péssima alimentação), bem como a utilização de duchas vaginais. TABELA 10 Principais grupos bacterianos vaginais FONTE Elaborada pelas autoras (2022). 57 O Mundo Microbiano Microbiota normal Capitulo 4 Olho A microbiota do olho é composta, principalmente, por difteroides, Staphylococcus epidermidis e estreptococos não hemolíticos. São encontradas com frequência espécies do gênero Neisseria e bacilos Gram-negativos. Saiba Mais Quer se aprofundar nesse tema? Leia o artigo Transplante de microbiota fecal no tratamento da infecção por Clostridium difficile: estado da arte e revisão de literatura (Messias et al.). Acesse clicando aqui. Resumindo Durante este capítulo, vimos os microrganismos que compõem o nosso organismo sem causar doenças. Pudemos perceber que diferentes regiões do nosso corpo vão ter uma microbiota característica daquele local, que irá favorecer os processos que ocorrem. Vimos que todo ser humano nasce estéril e, após o nascimento, o recém-nascido começa a adquirir os microrganismos desde o momento do parto. E esses microrganismos vão se alterando e se adaptando às fases da vida. Aprendeu que a microbiota exerce funções no nosso corpo, mas, principalmente, nos protege contra microrganismos patogênicos, prevenindo doenças. Entendeu o risco de utilizar antibióticos de forma incorreta, visto que pode alterar a microbiota normal. Também aprendeu que existem diversos fatores que podem alterar a nossa microbiota, inclusive higiene, estilo de vida, uso de antibióticos e alimentação. Compreendeu que a microbiota é muito importante não só para evitar patógenos, mas para manter o equilíbrio do organismo e poder ajudar na prevenção de doenças. https://www.scielo.br/j/rcbc/a/tT7LzGsGXD5t3xq6GptHSfd/?lang=pt 58 O Mundo Microbiano Referências LEVY, C.E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2004. Disponível em: https://bvsms. saude.gov.br/bvs/ publicacoes/manual_microbiologia_completo.pdf. Acesso em 27 nov. 2022. ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção em serviços de saúde, 2004. Disponível em: https://bvsms.saude. gov.br/bvs/ publicacoes/manual_microbiologia_completo.pdf. Acesso em: 27 nov. 2022. ANVISA. Microbiologia, 2004. 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