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11/05/15 1 O Aparato Transcricional Eucariótico O Genoma se expressa Tópicos abordados • A RNA polimerase eucariótica • Fatores transcricionais gerais • Etapas da transcrição • Complexo transcricional 11/05/15 2 RNA e o Dogma Central Proteínas regulatório estrutural enzimático codificador Não codificador Os moléculas de RNA brotam do DNA • Os RNA são produzidos a partir de regiões discretas, os cistrons 11/05/15 3 RNA Polimerase Eucariótica • Eucariotes tem mais de uma RNA polimerase RNA polimerase eucarióticas Enzima Localização Produto Atividade Relativa Sensibilidade à α-amanitina RNA pol I Nucléolo rRNA 50-70% Insensível RNA pol II Nuceloplasma mRNA 20-40% Sensível RNA pol III Nuceloplasma tRNA ~10% Pouco sensível Proteina ligadora doTata box • Todas as polimerases têm em comum a TBP (TATA Binding Protein), elemento guia para os demais fatores gerais de transcrição 11/05/15 4 TBP se associa aos TAFs • O TBP está associado aos TAF (TBP Associated factor) que dependendo da polimerase pode ser TAFI, TAFII ou TAFIII Promotor do tipo I • A RNA pol I reconhece um promotor bi-partido. Apenas o rRNA é produzido por essa polimerase 11/05/15 5 Promotor do tipo III • A RNA pol III reconhece promotores internos ao cistron. Tantos os tRNA, RNA 5 S e pequenos RNAs nucleares são produzidos por essa polimerase Promotor do tipo II • A RNA pol II apresenta o promotor mais estudado. A montagem do complexo de iniciação depende da entrada orquestrada de vários fatores gerais (basais) de transcrição 11/05/15 6 O complexo de Transcrição é montado pela adição sequencial de fatores basais Alguns desses fatores se ligam diretamente à região do promotor 11/05/15 7 Os fatores basais de Transcrição são encontrados em extratos nucleares Os fatores basais são fracionados e recomposto experimentamente Pull Down Assay Proteínas ligantes ao um determinado fator podem ser analisadas pelo ensaio de pull-down, que perimite o isolamento de proteínas baseada em afinidade 11/05/15 8 Fatores gerais de transcrição ü A montagem do complexo de iniciação é o principal ponto de controle da transcrição 1- Ligação de TFIID 2- A TFIID ( cerca de 800 kDa) contém a TBP + TAFs (TAFII) 3- TFIIDs contendo diferentes TAFs podem reconhecer diferentes promotores à alguns TAFs são tecido-específicos 4- Ligação serial dos outros fatores gerais de transcrição TFIIA, B, F, E, etc Um complexo de iniciação é montado sobre promotores para a RNA Polimerase II por uma sequência ordenada de associação entre fatores de transcrição. A montagem do complexo de iniciação da RNA polII 11/05/15 9 Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII O TFIID inicia o processo se ligando à região do tata box O T F I I H t e m u m a atividade proteína quinase que fosforila o CTD Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII libera a RNA Polimerase II do promotor Início da transcrição 11/05/15 10 1- TFIID se liga ao promotor (core) 3- TFIIB se liga ao complexo TFIID/TFIIA e recruta a pol II para o promotor 2- TFIIA estabiliza o complexo TFIID/promotor 4- TFIIE e só depois TFIIH se ligam ao complexo polimerase/promotor 5- TFIIH participa de duas formas: - com sua atividade ATPásica desenrola a hélice do DNA (girase) - sua atividade de proteína quinase fosforila o CTD 6- A transcrição se inicia 11/05/15 11 Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001. Ex: promotor de metalotioneína: proteção contra metais pesados Os promotores normalmente respondem a múltiplos sinais Elementos que regulam a transcrição pela RNA Polimerase II • Elementos que agem em cis – sequências regulatórias • Elementos que agem em trans – Fatores de transcrição que ligam nos elementos cis 11/05/15 12 Descobrindo os elementos que operam em cis Elementos em cis são encontrados deletando progressivamente a região do promotor Descobrindo os elementos que operam em trans Com o elemento em cis em mãos, podemos encontrar os elementos que atuam sobre eles observando a capacidade de ligação em gel de retardo de mobilidade 11/05/15 13 Refinado a análise O sítio de ligação do fator de transcrição (TF) no elemento cis é precisamente mapeado por footprinting Os promotores de metazoários são mais complexos 11/05/15 14 Promotores eucarióticos da RNA pol II apresentam uma grande diversidade de sequências curtas importantes para a eficiência e regulação da transcrição Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001. Os promotores do tipo II apresentam inúmeros elementos regulatórios que podem ser tecido específico ou estágio específico A transcrição do gene TTR (transthyretine) requer uma forte cooperatividade entre fatores regulatórios durante a montagem do complexo de iniciação. Nos hepatócitos, a transcrição do gene TTR é controlada por pelo menos 5 diferentes ativadores transcricionais específicos 11/05/15 15 A conexão entre os elementos regulatórios e o complexo basal de iniciação é mediado pelo complexo mediador Complexo mediador é formado por um grande número de subunidades 11/05/15 16 O Complexo pré-transcricional inclui ativadores, fatores gerais e modeladores de cromatina A maquinaria basal interage com os vários elementos ativadores 11/05/15 17 A cauda CTD tem papel nas três etapas da transcrição • O mRNA possui uma estrutura especial na extremidade 5’ ü Os transcritos de RNA pol II contêm CAP 11/05/15 18 • Adição do CAP é concomitante à síntese do mRNA e depende da cauda CTD fosforilada A elongação depende de fatores que gerenciem a cromatina, como o FACT 11/05/15 19 A terminação acontece com a adição de uma cauda poli A ü Os transcritos de RNA pol II são poli-adenilados Após a liberação do RNA poliA+, a transcrição é terminada pelo desacoplamento da RNA pol II Esse mecanismo ainda não é bem estabelecido Modelo Torpedo Modelo alostérico
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