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11/06/15 1 Biossíntese Proteica Traduzindo o código genético em proteínas Biossíntese proteica – conhecer o mecanismo de biossíntese proteica – identificar as 3 três fases da biossíntese entendendo os fatores envolvidos em cada etapa – entender como a estrutura do ribossomo permite uma síntese eficiente. 11/06/15 2 Histórico • Inicialmente o processo de síntese protéica era visto como o reverso à degradação observado no processo digestivo • Apesar de dependente do ribossomo, os pesquisadores da época não deram atenção aos novidades na área da biologia molecular e negligenciaram o modelo de fluxo informacional proposto por Watson e Crick • A observação de que RNAse destruía a capacidade dos extratos celulares de sintetizar proteínas servia apenas de evidência de que o local de síntese era no ribossomo Bioquímicos conservadores • Os RNA solúveis foram interpretados por Crick como sendo os "adaptadores". Elemento chave na hipótese do acidente congelado • Os experimentos de Nirenberg e Khorana foram decisivos para mostrar a existência de um código de tradução da informação contida no RNA • Só então o processo passou a ser encarado como dependente de "RNA” • Só mais tarde o mRNA foi finalmente reconhecido como a molécula molde. 11/06/15 3 O ribossoma sedia a síntese LOCAIS DE SÍNTESE DE PROTEÍNA os ribossomos aparecem no citosol e em organelas 11/06/15 4 Em procariotos a síntese está associada à transcrição A síntese proteica é feita normalmente em múltiplos ribossomos, os Poliribossomos (Polissomos) 11/06/15 5 Diagrama de um poliribossomo O Ribossomo é formado de duas subunidades 11/06/15 6 O ribossomo é um máquina complexa e conservada • O rRNA é o principal componente do ribossomo onde assume uma estrutura tridimensional complexa dividida funcionalmente em domínios onde se associam as várias proteínas ribossomais 11/06/15 7 O tRNA trabalha em sintonia com o ribossoma levando os aminoácidos até o sítio ativo O ribossoma apresenta três sítios distintos para tRNAs • Sítio P: sustenta a cadeia nascente ligada ao tRNA; Sítio A: entrada de tRNA carregados Sítio E: a saída dos tRNA descarregados 11/06/15 8 Detalhe da interação ribossomo-tRNA-mRNA O mRNA entra como mensageiro do código 11/06/15 9 E a proteína nascente saí por um túnel Polipeptídeo nascente Canal de saída do polipeptídeo 11/06/15 10 O coração catalítico do ribossomo é a peptidil-transferase, uma ribozima 11/06/15 11 Lodish et al. (2004). Molelcular Cell Biology (5ª edição) Três tipos de RNA atuam na síntese de proteínas Três tipos de RNAs: mRNA tRNA rRNAs E proteínas acessórias E depende do pareamento de bases entre o anticodon do tRNA e os codons complementares no mRNA A formação da ligação peptídica é catalisada por um dos rRNAs O Processo de Síntese • O processo de Síntese ocorre em três fases claramente distintas – Iniciação – Elongação – Terminação Variações do processo em eucariotos e procariotos 11/06/15 12 Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) Visão geral dos eventos no processo de tradução O CICLO DO RIBOSSOMO A formação do complexo de iniciação ü A formação do complexo Ribossomo-tRNA-mRNA finaliza a etapa de iniciação 11/06/15 13 A fase de Iniciação • primeiro passo do processo consiste no reconhecimento do mRNA e do tRNAimet pela subunidade menor do ribossomo A fase de Iniciação Existem dois tRNAmet ü Um exclusivo para a iniciação ü Um exclusivo para a elongação 11/06/15 14 Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) um tRNA especializado (tRNAi) carregado com uma Metionina modificada (fMet) liga-se diretamente à subunidade ribossomal menor Em bactérias, uma particularidade: A etapa de Iniciação • O mRNA é reconhecido diferentemente em procariotes e eucariontes – Em bactérias o reconhecimento do mRNA é feito por uma região específica do rRNA 16S – A sequência no mRNA complementar à extremidade 3’ do rRNA é chamada região Shine-Dalgarno (ou RBS). 11/06/15 15 Existe consenso entre mRNA bacterianos para a sequência Shine-Dalgarno Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) mRNA bacteriano pode iniciar a síntese de proteínas em vários pontos à mRNA policistrônico à Modelo do operon à Dependente de RBS RBS – “Ribossome Binding Site” ou sequência de Shine-Dalgarno 11/06/15 16 A procura de um AUG • Em eucariontes, o mRNA é reconhecido pela presença do CAP ü o AUG é encontrado por varredura (scanning) AAAAAAAAAA Estrutura do 5´CAP Típico mRNA eucariótico Esquema da iniciação em procariontes 11/06/15 17 Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) Iniciação em detalhes Ø subunidade menor do ribossomo (30S) Ø 3 fatores de iniciação da tradução: IF1, IF2 e IF3 são fundamentais para a formação do complexo Ø IF3: bloqueia a reassociação da 30S com a 50S Ø IF1: bloqueia a ligação de tRNAs carregados ao sítio A da subunidade 30S Ø IF2: apresenta atividade GTPase e interage com 30S, IF1 e fMet-tRNAi Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) ü IF3 impede a associação das subunidades maior e menor 11/06/15 18 Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) ü Neste estágio, dos 3 sítios de ligação para tRNA, apenas o sítio P é capaz de ligação a tRNA na presença dos IFs IF1 e o IF2 se associam à subunidade menor juntamente com uma molécula de GTP Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) O mRNA é posicionado pelo pareamento com o RBS A ligação do fMet-tRNAifmet ao sítio P é facilitada pelo complexo IF2-GTP O AUG é posicionado no sítio P 11/06/15 19 Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) O rRNA 16S interage com o RBS para posicionar o AUG no sítio P do ribossomo interações por pareamento de bases entre o RBS e o rRNA16S Após a ligação da subunidade ribossomal maior, o AUG fica posicionado no sítio P Watson et al. (2008). Molelcular Biology of the Gene (6ª edição) o pareamento de bases AUG com fMet-tRNAi provoca uma mudança conformacional na subunidade 30S liberação de IF3 ligação da subunidade 50S 11/06/15 20 Watson et al. (2008). Molecular Biology of the Gene (6ª edição) A entrada da subunidade 50S estimula a atividade GTPase de IF2 IF2•GDP tem baixa afinidade pelo ribossomo Fim da Iniciação Ribossomo 70S montado no AUG do mRNA e pronto para receber o próximo aa-tRNA no sítio A Etapa de iniciação em eucariotos • O processo é homólogo ao que acontece em bactérias • Um número maior de fatores de iniciação estão envolvidos • O reconhecimento do mRNA é a maior diferença 11/06/15 21 A dissociação das subunidades do ribossomo eucariótico é garantida pela associação dos fatores eIF1, eIF1A, eIF3 e eIF5 à subunidade 40S O Complexo ternário eIF2-GTP-tRNAimet se associa ao sítio P completando o complexo de pré-iniciação 43S 5’ CAP E paralelo o mRNA é reconhecido pelo fator eIF4 em sua extremidade 5’ por meio do CAP 11/06/15 22 O Complexo pré-iniciação se associa ao complexo mRNA-eIF4 Complexo de pré- iniciação 48S Complexo de pré- iniciação43S O Complexo pré-iniciação 48S procura o códon de iniciação pelo processo de scanning O Pareamento correto do Met-tRNAimet com o primeiro AUG muda a conformação do complexo 48S liberando o fator eIF1 e eIF5, provocando a hidrólise do GTP complexado ao eIF2 O eIF2GDP não mais se adequa ao complexo de iniciação e sai, sendo substituído pelo fator homólogo eIF5BGTP 11/06/15 23 A saída dos fatores que mantinham as subunidades separadas, provoca a reassociação da subunidade maior. A mudança conformacional associada acompanha a hidrólise do GTP O eIF5BGDP se dissocia levando junto o eIF1A. Com isso o sítio A fica liberado e o complexo 80S formado, pronto para a elongação Complexo 80S Fim da Iniciação Durante a biossíntese proteica o mRNA eucariótico torna-se circular pela ação dos diversos fatores que interagem nas duas extremidades do mRNA (5’ e 3’) 11/06/15 24 Os mecanismo são conservados em procariontes e eucariontes, e os fatores tem correspondentes nos dois IF3 corresponde ao eIF1 IF2 corresponde a: eIF2 eIF5B IF1 corresponde ao eIF1A Fator procariótico Função Fator eucariótico Iniciação IF1 Estabiliza o complexo de iniciação IF2 Liga-se ao fmet-tRNA e hidrolisa GTP quando da associação com a 50S eIF-2 IF3 Previne a reassociação das subunidades eIF-3 liga em 40 S eIF-6 liga em 60 S Liga-se ao CAP eIF-4 Desnatura o RNA eIF-4 A e B GTPase que dissocia eIF-2 e eIF-3 e-IF-5 Fatores de Iniciação
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