Aula de Citometria de Fluxo

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
*
Citometria de Fluxo 
*
*
CITO - CÉLULA
 METRIA – MEDIDA
 FLUXO - MOVIMENTO
Citometria de Fluxo 
*
*
É uma técnica para separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas (ex: células, cromossomos e microvesículas) suspensas em meio líquido.
Citometria de Fluxo 
*
*
A principal vantagem é que esta tecnologia permite estudar várias características de uma célula de forma rápida e por vários parâmetros (multiparamétrica)
Citometria de Fluxo 
*
*
Morfologia celular: 
Mede o tamanho relativo da célula - FSC (Forward Scatter)
Mede a granulosidade ou complexidade da célula – SSC (Side Scatter)
 Intensidade de fluorescência 
FL (vários canais: FL1, FL2, FL3, FL4, FL5...)
Parâmetros 
*
*
Parâmetros: FSC e SSC
FSC – resultado com baixo ângulo de dispersão
SSC - Espalhamento com ângulo de 90 graus
*
*
Somente com esses parâmetros, já são possíveis a diferenciação celular e a classificação em linfócitos, monócitos e granulócitos em uma única amostra.
Citômetro de Fluxo 
*
*
Através de parâmetros como tamanho e granulosidade, é possível a distinção de populações celulares.
MACRÓFAGO 
LINFÓCITO 
*
*
Separação de células sanguíneas
Granulosidade 
Tamanho
*
*
Outros exemplos de gráficos dos parâmetros: tamanho e granulosidade
*
*
E se quisermos distinguir outras células?
Ex: 
Linfócito T helper (CD4), linfócito T citotóxico (CD8), linfócito T reg, linfócito B?
*
*
Parâmetro – Intensidade de Fluorescência
 Anticorpos Monoclonais conjugados à fluorocromos
Fluorocromo- Depois de excitados por um comprimento de onda específico, emitem
fluorescência em um comprimento de onda maior
*
*
*
*
*
*
FLUORESCÊNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde.
O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja.
O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.
*
*
FLUOROCROMOS
FITC (ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA)
 PE (FICOERITRINA)
 ECD (FICOERITRINA TEXAS Red X)
 PC5-PECy5 (FICOERITRINA CIANINA 5.1)
 APC (ALOFICOCIANINA)
*
*
O que fazer para não ter vazamentos ?
Fazer a compensação de fluorocromos!
1- Passar as amostras puras (sem fluorocromos)
2- Passar as amostras marcadas separadas
3- Passar as amostras do seu experimento. 
*
*
Citômetro de Fluxo 
A fluorescência emitida por cada fluorocromo ligado à célula em análise é detectada por fotodetectores e convertida em sinais que são processados, quantificados e analisados por um computador. 
*
*
Citometria de Fluxo 
AS CÉLULAS OU PARTÍCULAS BIOLÓGICAS PASSAM NUM FILETE ÚNICO. 
Esta técnica permite a análise de vários parâmetros simultaneamente. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula. 
*
*
*
*
Facs Acuuri 
*
*
*
*
*
*
*
*
Que partículas podem ser analisadas no citômetro?
célula;
organelas citoplasmáticas;
cromossomos;
células agregadas;
bactérias;
fungos;
Protozoários;
*
*
Parâmetros que podem ser analisados: 
Tamanho e a forma das células;
 Granulosidade;
 Conteúdo de DNA e RNA; 
 Açúcares de superfície;
 Integridade e permeabilidade da membrana celular;
 Receptores de superfície celular;
 Morte celular programada (Anexina e PI ou 7AAD)
*
*
Citômetro de Fluxo
Sistema Fluído
 Sistema óptico
 Sistema eletrônico
*
*
Sistema Fluído- Introduz e alinha as partículas em um fluxo contínuo para análise
Sistema óptico- Gera e coleta os sinais de luz
 Sistema eletrônico- Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos. Isto permite a análise posterior pelo computador (software)
Conjunto de sistemas
*
*
Sistema de fluido 
Low Sample Pressure 12µl/min
Sample
Laminar Flow
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
Sheath
Sheath
Sample
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample Pressure 60µl/min
*
*
Sistema de óptico
SISTEMA COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
*
*
Sistema de eletrônico
CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
*
*
Sistema Eletrônico
*
*
Visão dos dados coletados
*
*
Aplicações
Imunofenotipagem
 Diferenciação de populações celulares- Marcação de moléculas de superfície que são utilizados na fenotipagem como marcadores
*
*
*
*
Estudo da viabilidade celular
Aplicações
Iodeto de propídio que intercala-se entre as bases nucleotídicas
*
*
Aplicações
Ftores de transcrição
Citocinas
*
*
VANTAGENS 
 Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
 Grande número de células com rapidez;
 Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; 
 Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares
*
*
Questões
1- Defina Citometria de Fluxo.
2- Que parâmetros são avaliados pela citometria de fluxo sem marcação com fluorocromo?
3- Quais são as vantagens do uso desta técnica?
4- Quantos parâmetros podem ser avaliados por citometria?