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Aula - Isolamento de microrganismos - I

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Concurso público Edital 18/2010
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ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS 
Disciplina: Tecnologia Processos Fermentativos I
Prof. Msc Alex Sander Rodrigues Cangussu
E-mail: alexcangussu@yahoo.com.br
Concurso público Edital 18/2010
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Porque são facilmente cultiváveis in vitro;
Porque se reproduzem rapidamente;
Porque utilizam substratos baratos para sua nutrição;
Porque sintetizam vários produtos de interesse;
Produtos/serviços de micro-organismos...
Concurso público Edital 18/2010
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A grande diversidade de espécies pode dificultar o início de um trabalho de isolamento, dessa forma é essencial estabelecer o objetivo da sua pesquisa:
Qual o problema em questão?
O que eu quero isolar? ( ou seja, qual grupo microbiano pode (com base na literatura) atuar melhor nesta problemática?)
Qual será minha fonte de isolamento?
Concurso público Edital 18/2010
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Coletar uma espécie microbiana a partir de sua forma nativa e transferi-la para o cultivo no laboratório (in vitro);
O sucesso do cultivo in vitro dependerá da habilidade deste organismo em assimilar os nutrientes presentes no meio de cultivo com fonte de carbono para o seu metabolismo;
Pode ser necessário avaliar mais de um meio de cultura, especialmente aqueles ricos em suplementos orgânicos de nitrogênio (extrato de carne, peptona, extrato de levedura), vitaminas, minerais e micronutrientes;
Após o isolamento, é necessário manter a cultura pura a partir de uma única colônia, onde todas as células são idênticas;
Isolar nem sempre significa descobrir, e esse reconhecimento somente ocorre após uma identificação molecular do isolado.
Concurso público Edital 18/2010
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Concurso público Edital 18/2010
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Concurso público Edital 18/2010
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Tomar uma porção/amostra de material e levá-lo ao laboratório para processamento (maceração, homogeneização, diluição  depois cultivo em ágar).
Fazer uma raspagem da superfície ou ambiente de onde se deseja isolar utilizando aparatos esterilizados (swab).
Coletar esporos ou partes do organismo (apenas para fungos macroscópicos).
Concurso público Edital 18/2010
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Exemplo 1: isolamento de bactérias lácticas nativas de produtos cárneos curados artesanais (salame, lingüiça)
1º) Coleta da amostra em condições de assepsia.
2º) Transporte até o laboratório (refrigeração? Tempo?)
3º) Determinar uma alíquota analítica homogênea a partir da amostra total.
4º) Pesar (medir volume para líquidos) a quantidade correspondente a 25 g (ou 25 mL) de amostra.
5º) Realizar uma diluição-mãe ao nível de 10%.
Concurso público Edital 18/2010
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Diluição decimal seriada
Concurso público Edital 18/2010
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Diluição decimal seriada permite obter colônias isoladas (puras = 1 colônia = clones idênticos).
O cultivo in vitro nas placas de Petri deve atender aos requisitos exigidos pelo organismo que se deseja cultivar:
Meio de cultura: básico ou rico em nutrientes?
Tensão de Oxigênio: aeróbico, anaeróbico, microaeróbico?
Temperatura ótima: psicrófilo, mesófilo, termófilo?
pH ótimo: acidófilo, neutrófilo ou alcalifílico?
Tempo de cultivo: conhecer a curva de crescimento...
Exemplo: ágar MRS, pH 6.5, atmosfera microaerófila, estufa bacteriológica a 35°C durante 48 horas.
Concurso público Edital 18/2010
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Tipos de meio de cultura:
Meios seletivos –promovem o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros pela ação de antibióticos ou inibidores em sua formulação.
Meios diferenciais – facilitam a separação presuntiva de espécies de microrganismos que estejam colonizando um mesmo ecossistema, permitindo sua distinção a partir de colônias com características fenotípicas diferentes (morfologia e coloração).
Meios de enriquecimento – são meios ricos que estimulam o crescimento de microrganismos fastidiosos pela adição de substâncias ricas como sangue e soro animal. Geralmente são meio líquidos (caldos).
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Técnicas 
de isolamento de 
colônias isoladas:
Esgotamento por estrias
Método pour-plate 
	(em profundidade)
Método over-plate 
 ou Spready Plate
	(por derramamento)
Concurso público Edital 18/2010
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Exemplo 2: isolamento de 
actinomicetos com ação antimicrobiana 
contra fungos (antifúngico). 
Actinomicetos??
Qual a provável fonte de isolamento?
Como constatar se ocorre 
a síntese de antibiótico por 
alguma(s) da(s) cepa(s) isolada(s)?
Concurso público Edital 18/2010
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Concurso público Edital 18/2010
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Outras formas de avaliar potencial de síntese 
de compostos antagônicos
Técnica de difusão em poços
Técnica de difusão em discos de papel
Utilizando apenas o caldo (sobrenadante) livre de células após o cultivo em laboratório
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Técnica de difusão em poços
5- As placas confec-cionadas vão para incubação em estufa (condições ótimas da linhagem indicadora).
6- Verificação dos resultados ao final do período de incubação. 
Concurso público Edital 18/2010
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Resultado = presença ou ausência de halo de inibição sobre a cultura indicadora = representa a sensibilidade desta às possíveis substâncias tóxicas presentes na amostras (ação fungicida, bactericida, bacteriostática).
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Utilizando pequenos pedaços de papel esterilizado e encharcado com a amostra = ocorre difusão do papel para o ágar = possibilidade de inibição do microorganismo indicador.
Técnica de difusão em discos de papel
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Exemplo 3: isolamento de fungos filamentosos produtores da enzima celulase. 
Qual a fonte de isolamento?
Como selecionar diante de uma amostra de um ambiente natural (com incontáveis microorganismos) somente aquelas linhagens que são efetivamente produtoras de celulase como metabólito (seja primário ou secundário)?
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Qual aditivo deve compor a fonte de Carbono na composição do meio de cultura?
Concurso público Edital 18/2010
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A partir de amostras de água
Método de diluição decimal seriada (amostra líquida – diluição-mãe 10% idem anterior)
Método de filtragem/carimbo:
Princípio de retenção das células em membrana filtrante de 0.22 micrômetros.
Carimbo da membrana em placa de Petri contendo ágar solidificado.
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Metabolismo fúngico é mais lento que o bacteriano, uso de agentes antibacterianos se faz obrigatório (antibióticos incorporados ao meio de cultura, ex. cloranfenicol 50 ppm);
Meios de cultura normalmente mais simples do que os meios para bactérias – meios pobres;
Temperatura de crescimento mais branda (próxima a temperatura “ambiente” de 25°C);
Coleta de material de isolamento a partir de hifas ou esporos.
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Método WARCUP de isolamento de fungos do solo: 1,0 grama de solo é adicionado ao meio pour plate de placas de Petri contendo um meio pobre (ex: malte-ágar, PDA) e aguarda-se o desenvolvimento miceliar durante 5-7 dias.
Se houver crescimento muito intenso, se faz necessária uma diluição decimal da amostra antes do isolamento.
Método do implante = inserir uma porção do micélio do fungo no centro de uma placa de Petri com meio de cultura.
Método de filtragem/carimbo = também se aplica porém com membranas de 0.45 micrômetros.
Transferência de esporos = possível captura a partir do ar.
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Fungos em geral: PDA (potato dextrose agar) ou Sabouraud
Leveduras: YM (yeast extract medium) ou PYG (peptone yeast glucose)
Bactérias lácticas: MRS (Man, Rogosa & Sharpe)
Bactérias em geral: caldo/ágar Nutriente ou BHI (brain heart infusion)
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SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. v.2. São Paulo: E. Blücher, 2001.
LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e enzimáticos. v.3. São Paulo: E. Blücher, 2001.
LIMA, N.; MOTA, M. Biotecnologia Fundamentos e Aplicações – Ed. Lidel, 2003.
PESSOA-JR.; KILIKIAN, B. V. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri, SP: Manole, 2005, 444p.
BON, E. P.S.
Enzimas em biotecnologia: produção, aplicações e mercado. Rio de Janeiro:Interciência: UFRJ:CAPES:FAPERJ:FCT,2008, 506p.
AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A. Biotecnologia Industrial: Biotecnologia na produção de alimentos. v.4. São Paulo: E. Blücher, 2001.
Bibliografia Recomendada
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BAILEY J. E. & OLLIS, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals. MC Graw-Hill, 1986
DORAN, P.M.Bioprocess Engineering Principles. Academic Press Inc, San Diego, 1995, 439p.
MADIGAN, M.T. ; MARTINKO, J.M., PAKER, J. Brock biology of microorganisms. 9th Ed. Prentice Hall, 2000, 989p.
NAJAFPOUR, G.D Biochemical Engineering and biotechnology. 1 ed. Amsterdam: Elsevier B.V, 2007, 421p
PANDEY, A; SOCCOL, C.R; RODRIGUEZ-LEON, J.A; NIGAM, P.Solid-State Fermentation in Biotechnology: Fundamentals and Applications, Asiatec Publishers Inc, New Delhi, 2001, 221p.
ROUSSOS, S., SOCCOL, C.R., PANDEY, A., AUGUR, C. New horizons in Biotechnology. Kluwer Academic Publischers, Netherlands, 2003, 449p..
Artigos científicos referentes aos temas dos Seminários - definido pelo Prof.).
Bibliografia Recomendada
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
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