Relatório "Microbiologia do Solo"

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Disciplina: Microbiologia Ambiental
Professora: Denise Martins
Microbiologia do Solo
	Alunas:
	Cibelle Lima
	Eliana Theodoro
	Giovanna Martins
	Maria Lídia Oliveira
	Maylla Talavera
Turma CAM 382
Data de Entrega: 06/04/2015
Sumário
Introdução	3
Procedimentos	5
Resultados e Discussão:	7
Meio PCA	7
Meio Saboraud	9
Meio mineral c/ Petróleo	11
Meio mineral c/ Tolueno	12
Meio mineral c/ Ciclohexano	12
Meio mineral c/ Hexano	13
Meio para Actinomicetos	13
Meio para Amonificantes	14
Meio para Amilolíticos	14
Conclusão	15
Referências:	16
Introdução
Nota-se cada vez mais a dependência do mundo pelo petróleo e seus derivados para diversas atividades, principalmente no campo industrial. Entretanto, a poluição em solos e corpos hídricos causada por tal composto é um dos maiores problemas ambiental atualmente, o que pode acontecer durante a exploração, o refino, o transporte e as operações de armazenamento. Por exemplo quando ocorre o vazamento de gasolina em solos durante o transporte, uma das principais preocupações é a contaminação das águas subterrâneas, que também podem contaminar, especialmente, os aquíferos que são usados como fontes de abastecimento de água para o consumo humano.
 Devido a isso, várias técnicas vem sendo desenvolvidas para a remediação desses sítios contaminados Dentre elas, técnicas de biorremediação se destacam por ser uma alternativa viável e têm sido alvo de diversos estudos a fim de acelerar o processo de descontaminação com menor custo e menor dano ambiental. Neste contexto, bactérias aeróbicas e anaeróbicas têm demonstrado grande potencial para a remediação de poluentes do petróleo, sendo utilizadas com sucesso em diversas técnicas, como atenuação natural, bioaumentação, bioestimualação, produção de biossurfactantes, entre outras. 
O petróleo é um composto orgânico, formado por processos biogeoquímicos, constituído em sua maior parte por uma mistura complexa de hidrocarbonetos. Sua composição varia em função de sua localização geográfica e das condições físico-químicas e biológicas que o originaram. Assim, a maior parte dos componentes do petróleo (de 60% a 90%) é biodegradável. Entretanto, o restante (de 10% a 40%), em estado bruto ou refinado, logo, sua biodegradação trata-se de um processo lento, podendo levar décadas até a total descontaminação do ambiente. 
Ainda tratando-se de uma porção menor, é importante ressaltar que isto representa toneladas de poluentes impactando diversos ecossistemas e simultaneamente bioacumulando e biomagnificando na cadeia trófica. O caminho destes compostos após uma contaminação dependerá da interação entre vários fatores, onde pode-se destacar a degradação microbiana (Crapez et al. 2002). A existência dos hidrocarbonetos em todo o planeta pode justificar a habilidade que muitas espécies microbianas utilizam estes compostos como substrato de crescimento, degradando poluentes do petróleo e utilizando-os como fonte de carbono e energia (Boopathy 2000, Ramsay et al. 2000, Widdel & Rabus 2001, Díaz 2004, Mandri & Lin 2007). Para isso, necessita-se quebrar pelo menos parte da molécula, em um composto mais simples, intermediário na via metabólica (Boopathy 2000, Widdel & Rabus 2001, Van Hamme et al. 2003, Díaz 2004, Ferguson et al. 2007, Jacques et al. 2007, Mandri & Lin, 2007). 
Todavia, algumas características das bactérias facilitam sua ambientação a várias condições ambientais, como seu rápido crescimento, sua versatilidade metabólica, plasticidade genética e rápida adaptação a variações do meio. E para seu crescimento e sobrevivência, bactérias precisam basicamente de energia, carbono e nutrientes (Sódio, Fósforo, Enxofre, Potássio, Cálcio, Magnésio, entre outros.) (Martins 2004). Várias vias metabólicas de degradação dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) foram identificadas em diferentes bactérias, uma vez que a quebra destes compostos aromáticos pode ser feita aerobicamente ou anaerobicamente. Nos ambientes naturais, a maior parte da matéria orgânica é mineralizada aerobicamente, mas este processo também pode ocorrer na ausência de oxigênio (Smith 1990, Hopper 1991). No entanto, de acordo com Díaz (2004), a degradação microbiana do petróleo e seus produtos refinados é muito mais rápida em condições aeróbicas do que em condições anaeróbicas.
Procedimentos
Após fazer a assepsia da bancada, foram separados os materiais que mais a frente seriam levados a esterilização como: placa de preti, as ponteiras e os meios de cultura. Juntou-se algumas placas de petri limpas e secas, embalou-se as placas em oito para facilitar a estocagem. Colocou-se então as placas no centro do papel e embrulhou-se reforçando com barbante e identificando-se com nome, data e turma. Já as ponteiras utilizadas nas pipetas automáticas foram embrulhadas com alumínio de três em três depois com papel de jornal e sendo reforçada com barbante. 
Cada grupo da turma CAM 382 ficou responsável de preparar um meio para ser utilizado na análise de solos por biomerrediação como: meio sabouraud, PCA e Meio Mineral , ciclohexano, tolueno e petróleo bruto. Em seguida, todo o material devidamente embrulhado foi levado para ser esterilizado na autoclave.
Pesou-se 10,04 g de amostra solo dentro de um balão de fundo chato de 300 mL que já continha água. Verteu-se essa solução contendo fontes de carbano (petróleo) para quatro tubos de ensaio com 1 mL do mesmo misturando-o com 9 mL de solução salina sendo que em cada tubo retirou-se uma alíquota de 1 ml da solução com uma pipeta automática e transferiu-se para outro tubo de ensaio e misturou-se completamente até que ocorresse todas as diluições (até 10-4) pela técnica de nebulização, sobre o meio semeado com as amostras previamente enriquecidas. As colônias isoladas em placas de Petri feitas em duplicata, contendo os meios sólidos, PCA para bactérias , Sabouraud –para fungos filamentosos e leveduras Meio Mineral degradadores de- ciclohexano, tolueno e petróleo bruto - que adicionou-se no dessecador com auxilio de conta gotas algumas gotículas de tolueno e ciclohexano em um papel de filtro acoplada na tampa da placa. Colocou-se os meios para serem incubados na estufa a 35°C (bactérias) em 24h e 30°C (leveduras e fungos filamentosos) em 24/48h. 
Figura 1 - Demonstração das diluições feitas
 
Resultados e Discussão:
O solo provavelmente é o ambiente que apresenta uma maior quantidade de microorganismos em relação a qualquer outro habitat. Na maioria das vezes o solo por apresentar condições estressantes tem boa parte de sua população microbiana em estado dormente ou morta. Chegou-se a essa conclusão devido a estudos in situ utilizando microscopia eletrônica. Esses microorganismos apresentam variadas funções, como: Fixação biologica de nitrogênio, decomposição de matéria orgânica, transformações bioquímicas, solubilização de minerais entre outras.
Sendo: 
- Grupo 1: Solo contaminado com 3% de petróleo
- Grupo 2: Solo original s/contaminação
- Grupo 3: Solo contaminado com 5% de petróleo
- Grupo 4: Controle – Não contaminado
Legenda: 
-- > Não utilizou esse meio
- > Não apresentou resultados
Segue os resultados da prática de análise microbiológica do solo:
Meio PCA
PCA é o Agar padrão para contagem de bactérias. As bactérias encontradas no grupo 1 e 3 apresentaram o mesmo aspecto, branca leitosa, lisa e brilhosa. Já as do grupo 3 se apresentaram em 3 colorações diferentes: Amarelada, rosa clara e branca.
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-5
	Incontável
	161 Colônias de bactérias
	Incontável
	12 Colônias de bactérias e 2 Colônias de fungos
	10-5
	6 Colônias de bactérias
	100 Colônias de bactérias
	Incontável
	9 Colônias de bactérias
	10-6
	2 Colônias de bactérias
	74 Colônias de bactérias
	2 Colônias de bactérias
	1 Colônia de bactérias
	10-6
	2 Colônias de bactérias
	Incontável
	5 Colônias de bactérias
	3 Colônias de bactérias e 5 Colônias de fungos
	10-7
	-
	18 Colôniasde bactérias
	4 Colônias de bactérias
	2 Colônias de bactérias
	10-7
	1 Colônia de bactérias
	20 Colônias de bactérias
	5 Colônias de bactérias
	-
O resultado do grupo 2 é de 72 horas, ao contrário dos outros grupos que apresentam os resultados de 24 horas de incubação.
	Diluição
	Grupo 2 – 24 Horas
	10-5
	77 Colônias de bactérias
	10-5
	18 Colônias de bactérias
	10-6
	27 Colônias de bactérias
	10-6
	53 Colônias de bactérias
	10-7
	-
	10-7
	-
Meio Saboraud
O meio Saboraud é utilizado para cultivo de fungos. O que propicia o crescimento de fungos nesse meio é o fato de que a peptona micológica presente fornece os componentes nitrogenados enquando a dextrose é a fonte de energia. Tendo uma alta concentração de dextrose intercalada com um baixo pH é inibida a contaminação por bactérias e favorece o crescimento de fungos. Ainda assim uma das placas de diluição 10-4 apresentou uma pequena colônia de bactéria, branca leitosa, lisa e brilhosa. 
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-4
	1 Colônia de bactéria
	7 Colônias de fungos
	4 Colônias de fungos
	3 Leveduras e 2 Colônias de fungos
	10-4
	-
	6 Colônias de fungos
	1 Colônias de fungos
	1 Leveduras e 6 Colônias de fungos
	10-5
	2 Colônias de fungos
	Incontável
	1 Colônias de fungos
	4 Colônias de fungos
	10-5
	-
	Incontável
	3 Colônias de fungos
	3 Colônias de fungos
	10-6
	3 Colônias de fungos
	6 Colônias de fungos
	1 Colônias de fungos
	-
	10-6
	Incontável
	Incontável
	1 Colônias de fungos
	-
O resultado do grupo 2 é de 72 horas, ao contrário dos outros grupos que apresentam os resultados de 24 horas de incubação.
	Diluição
	Grupo 2 – 24 Horas
	10-4
	3 Colônias de fungos
	10-4
	5 Colônias de fungos
	10-5
	12 Colônias de fungos
	10-5
	6 Colônias de fungos
	10-6
	-
	10-6
	1 Colônia de fungos
Foto da placa de diluição 10-6 do grupo 1 (Solo contaminado com 3% de petróleo) apresentando 3 colônias de fungos em que a parte superior é preta filamentosa e a inferior branca leitosa ondulada, a colônia se apresentava algodoada.
Já está outra placa de diluição 10-6 do mesmo grupo apresentou 3 colônias de fungos de cor bege, algodoada, ondulada e uma quantidade incontável de colônias lisas, branca leitosa e brilhosa de bordas irregulares.
Essa placa, do meio saboraud do grupo 4 (controle) representa a diversidade de microorganismos que podemos encontrar no solo. Como podemos ver os solos se mostraram imensamente ricos em relação a sua microbiota. 
Meio mineral c/ Petróleo
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-2
	7 Colônias de bactérias
	Incontável
	9 Colônias de bactérias
	3 Colônias de fungos
	10-2
	6 Colônias de bactérias
	Incontável
	7 Colônias de bactérias
	5 Colônias de fungos
	10-3
	3 Colônias de bactérias
	Incontável
	Incontável
	7 Colônias de bactérias
	10-3
	2 Colônias de bactérias
	Incontável
	13 Colônias de bactérias
	4 Colônias de bactérias e 3 Colônias de fungos
	10-4
	2 Colônias de bactérias
	1 Colônia de bactérias
	22 Colônias de bactérias
	3 Colônias de bactérias e 1 Colônias de fungos
	10-4
	1 Colônia de bactérias
	2 Colônias de bactérias
	10 Colônias de bactérias
	5 Colônias de bactérias
As colônias de fungos que cresceram nas placas do Grupo 4 (Grupo controle) apresentaram uma coloração verde. Este foi o único grupo que apresentou crescimento de colônias de fungos.
Como pode-se observar na foto acima espaços como este, indicado pelas setas, são resultado da degradação do petróleo realizada pelos microorganismos. A isso damos o nome de biorremediação, esse processo utiliza a capacidade dos microorganismos em degradar matéria orgânica e compostos orgânicos tóxicos, tanto de origem natural como sintético.
Meio mineral c/ Tolueno
Nesse meio só crescem microorganismos capazes de degradar alcanos.
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-1
	-
	--
	Incontável
	-
	10-1
	-
	--
	Incontável
	-
	10-2
	-
	--
	-
	-
	10-2
	-
	--
	-
	-
	10-3
	-
	--
	-
	-
	10-3
	-
	--
	-
	-
Meio mineral c/ Ciclohexano
Nesse meio só crescem microorganismos capazes de degradar cicloalcano.
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-1
	Incontável
	--
	-
	Incontável
	10-1
	Incontável
	--
	Incontável
	Incontável
	10-2
	Incontável
	--
	Incontável
	Incontável
	10-2
	Incontável
	--
	-
	Incontável
	10-3
	Incontável
	--
	-
	Incontável
	10-3
	-
	--
	-
	Incontável
Meio mineral c/ Hexano
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-1
	--
	--
	Incontável
	-
	10-1
	--
	--
	Incontável
	-
	10-2
	--
	--
	Incontável
	-
	10-2
	--
	--
	Incontável
	-
	10-3
	--
	--
	35
	-
	10-3
	--
	--
	16
	-
Meio para Actinomicetos
Os actinomicetos são um grupo bastante heterogêneo e apresentam características tanto de fungos quando de bactérias. Por exemplo, eles possuem micélio como os fungos e núcleo primitivo como as bactérias. No solo sua presença se reflete no cheiro característico devido a produção de substâncias voláteis denominadas geosmin. Eles representam uma pequena porção da microbiota do solo, mas somente eles são capazes de desempenhar algumas funções importantes como decomposição de fenóis, quitina, húmus e parafinas.
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-2
	--
	25 UFC
	--
	--
	10-2
	--
	20 UFC
	--
	--
	10-3
	--
	8 UFC
	--
	--
	10-3
	--
	5 UFC
	--
	--
	10-4
	--
	3 UFC
	--
	--
	10-4
	--
	2 UFC
	--
	--
O único solo testado para actinomicetos foi o solo original sem contaminação. Como podemos observar na tabela acima houve resultado positivo para todas as diluições, diminuindo em função da mesma. Só conseguiu-se realizar a contagem de colônias após a coloração.
 
Meio para Amonificantes
Os microorganismos amonificantes produzem amônio, que é liberado no solo. Esses microorganismos requerem uma grande demanda de carbono e energia suprida pela degradação microbiana de aminoácidos, açucares aminados e nucletídeos. Esse grupo de acordo com estudos se apresenta pouco sensível a influência de agroquímicos.
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-4
	--
	Incontável
	--
	--
As outras diluições não apresentaram resultado. 
Meio para Amilolíticos
	Diluição
	Grupo 1*
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	10-2
	--
	Incontável
	--
	--
	10-2
	--
	Incontável
	--
	--
	10-3
	--
	Incontável
	--
	--
	10-3
	--
	Incontável
	--
	--
	10-4
	--
	Incontável
	--
	--
	10-4
	--
	Incontável
	--
	--
As colônias apresentaram 2 colorações diferentes, 1 de coloração branca e outra de coloração amarela.
Conclusão
A partir dos resultados obtidos constata-se que a presença de fungos e bactérias no solo está diretamente vinculada à qualidade deste recurso natural, ou seja, quanto maior o número de microrganismos na terra, mais ampla será a capacidade de funcionamento do solo, em relação à manutenção da biodiversidade, qualidade da água, ciclagem de nutrientes e produção de biomassa. Logo, foi possível verificar que o solo controle e o solo original tiveram valores maiores de unidades formadoras de colônia, em comparação com os solos contaminados com 3 e 5% de petróleo. 
Portanto, as amostras que obtiveram uma menor faixa de crescimento microbiano, ou seja, os solos que possuem teor de poluentes inapropriados necessitam de tratamento e monitoramento, uma alternativa viável e barata para a remoção do contaminante – petróleo- é a biorremediação. O método de intervenção citado consiste na degradação bioquímica de substâncias por meio da atividade dos microrganismos presentes ou adicionados no local da contaminação. 
É importante destacar que qualquer tipo de tratamento escolhido deve encontrar-se em conformidade com a resolução CONAMA 420/2009,que dispõe sobre valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento ambiental de áreas contaminadas.
Referências:
Agar Sabouraud Dextrose - BIOSYSTEMS -http://www.biosystems.com.br/produto/1441/o-agar-sabouraud-dextrose-e-usado-para-cultivo-de-bolores-leveduras-e;
Microbiologia do Solo: microrganismos e interações - http://www.webartigos.com/artigos/microbiologia-do-solo-microrganismos-e-interacoes/27915/;
MARTINS, Marco Antonio - Microbiologia do Solo - UENF - Laboratório de Solos - http://www.uenf.br/Uenf/Downloads/LSOL_345_1113400965.pdf;
SANTOS, Suzana Souza dos; SOARES, Antônio Alves; MATOS, Antonio Teixeira de; MANTOVANI, Everaldo Chartuni; BATISTA, Rafael Oliveira; MELO, Julio César de; - Contaminação Microbiológica do Solo e dos Frutos de Cafeeiros Fertirrigados com Esgoto Sanitário - http://www.gpqa.ufv.br/Publicacoes/fertirrigacao/Contaminacao%20microbiologica%20do%20solo%20e%20dos%20frutos%20de%20cafeeiros%20fertirrigados%20com%20esgoto%20sanitario.PDF;
TONINI, Rita Maria Costa Wetler; REZENDE, Carlos Eduardo de; GRATIVOL, Adriana Dauldt - Degradação e Biorremediação de Compostos do Petróleo por Bactérias: Revisão - http://www.inct-tmcocean.com.br/pdfs/Produtos/Artigos_periodicos/62_ToniniRezende.pdf;
ANDRADE, Juliano de Almeida; AUGUSTO, Fabio; JARDIM, Isabel Cristina Sales Fontes - Biorremediação de Solos Contaminas por Petróleo e seus Derivados - http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-46702010000300002&script=sci_arttext;
Biorremediação - Universidade Estadual do Norte Fluminense - http://www.uenf.br/uenf/centros/cct/qambiental/ef_biorremediacao.html;
BORGES, André; ANTONIOL, Gabriela; PITTA, João Alfredo; MUSSATO, Pedro Ivo - Biorremediação - http://www2.sorocaba.unesp.br/professor/amartins/aulas/pea/biorremed.pdf;
CRAPEZ, M; BORGES, A; BISPO, M; PEREIRA, D. Biorremediação: Tratamento para Derrames de Petróleo. http://cienciahoje.uol.com.br/banco-de-imagens/lg/protected/pass/ch179/bioremed.pdf/view.