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* Faculdade Barão do Rio Branco Cidade Universitária – HISTOLOGIA – MÉTODOS DE ESTUDO E DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS Prof. Sodré de Araújo Freitas * NOÇÕES SOBRE OS NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO CORPO O que é célula? Menor porção do protoplasma que tem existência independente (diferentes formas e tamanhos). Tecido - agrupamento de células com mesma função Existem quatro tipos fundamentais de tecidos: Tecido epitelial – células que revestem superfícies, cavidades corporais ou formam glândulas; Tecido conjuntivo – células e abundante matriz extracelular (preenchimento ou sustentação); Tecido muscular – células com propriedades contráteis; Tecido nervoso – células que formam o cérebro, medula nervosa e nervos. Órgãos - unidades funcionais maiores, constituídos por diferentes tipos de tecidos. Ex: Esôfago: tecido epitelial estratificado, tecido conjuntivo, tecido epitelial glandular, tecido muscular. * Sistemas de órgãos - compreendem vários órgãos com funções relacionadas. Ex: Aparelho digestivo: boca língua esôfago estômago intestinos reto ânus Relação direta com outras disciplinas: Biologia celular, Citologia, Bioquímica, Fisiologia, Imunologia e Patologia base para a compreensão dos processos patológicos e suas causas. Pode ocorrer uma inter-relação entre os campos: Histofisiologia, Histoquimica, Imunohistoquímica, Histopatologia. NOÇÕES SOBRE OS NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO CORPO * NÍVEIS DE ORGANZAÇÃO DO CORPO ÁTOMOS MOLÉCULAS CÉLULAS TECIDOS ÓRGÃOS SISTEMAS ORGANISMO * Diferentes avanços técnicos têm permitido o desenvolvimento da pesquisa histológica. É necessário conhecimento a respeito dos princípios fundamentais dos métodos aplicados à histologia. Métodos histológicos classificados em 2 grupos: 1- que se baseiam na observação direta das células e tecidos vivos, 2- que se baseiam em análise material morto ou inanimado. MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA * MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA Maior parte dos tecidos não observada in vivo Fixação (preserva estruturas morfológicas) Principais fixadores: formol, álcool etílico e ácido acético. Observação de tecidos ao microscópio ótico - por transparência. Órgãos geralmente grandes – cortes finíssimos diversas etapas lâminas histológicas com preparados histológicos permanentes. Comum utilizar corantes (destacam determinadas partes das células, ex.: azul de metileno). Lâminas observadas ao microscópio óptico. * MÉTODOS DE ESTUDO DE CÉLULAS E TECIDOS ETAPAS: 1 – COLHEITA DO MATERIAL 2 – FIXAÇÃO 3 – INCLUSÃO 4 – MICROTOMIA 5- EXTENSÃO 6 – COLORAÇÃO 7 – MONTAGEM * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 1- COLHEITA DO MATERIAL Fragmentos de órgãos e tecidos a serem processados devem ser obtidos imediatamente após a morte do animal ou através de cirurgia a fim de evitar autólise. * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 2– FIXAÇÃO DO MATERIAL É o tratamento da peça histológica a fim de que possa observar ao microscópio os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser vivo ( impedindo a destruição das células por suas próprias enzimas –autólise- ou bactérias) Visa endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas subseqüentes da técnica histológica e pode ser feita por agentes físicos como calor ou por meios químicos. A) Fixadores: - Simples: formol, álcool etílico e metílico, ácido pícrico, ácido acético, ácido crômico, bicromato de potássio, etc. Misturas fixadoras: *líquido de Zenquer - mistura bicromato sublimado-ácido acético; *líqudo de Bouin – mistura picro-formol-acética; *líquido de Fleming- mistura crômico-ósmio-acética; *líquido de Helly - mistura bicromato-sublimato-formol. * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS b) Características de um bom fixador - Rapidez de atuação; - Poder de penetração e conservação das estruturas existentes in vitro; - Possibilitar o emprego subseqüente de técnicas adequadas ao estudo das estruturas. c) Prática da Fixação: Volume do fixador: + de 30 vezes o volume da peça. Tempo de fixação: variável - Tratamento subseqüente do tecido: variável de acordo com o fixador empregado. * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 3 – INCLUSÃO Consiste em uma série de processos visando a feitura do bloco. Parafina, celoidina, neve carbônica, etc. Parafina (M.O.) – não mistura em água – desidratação Resina (M.E.) – cortes ultra finos Etapas da Inclusão em parafina: Desidratação: passa-se o material em concentrações crescentes de álcool a 70%, 90% e absoluto. 2) Clarificação ou diafanização: o material é mergulhado em substâncias solventes de parafina. Ex: xilol, toluol, benzol, etc. * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS Etapas da Inclusão em parafina: 3) Penetração ou impregnação pela parafina: permitir a obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60°C, no interior da estufa. Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza. 4) Inclusão definitiva: é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada à temperatura ambiente, dá origem ao chamado “bloco de parafina”. A inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epóxi, sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica. * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 4) MICROTOMIA - Reduzir os tecidos a cortes finíssimos. - Os cortes são realizados em aparelhos especiais chamados micrótomos, dos quais existem modelos para inclusão em parafina, celoidina e congelação. - Os cortes mais utilizados são os de 5 a 7 μm de espessura. (1 um = 0,001 mm) * MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS * EXTENSÃO - os cortes provenientes da microtomia são “enrugados”. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58°C, e “pescados” com uma lâmina. Leva-se então, à estufa a 37°C, por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina contida na água quente. 5- EXTENSÃO * 6- COLORAÇÃO E 7- MONTAGEM - Para Microscopia óptica convencional, os cortes são cortados com uma lâmina de aço inoxidável e montados em uma lâmina de vidro revestida pelas com um adesivo. * ETAPAS DA TÉCNICA HISTOLÓGICA * 5- COLORAÇÃO a) Quanto à origem: naturais (carmim, hematoxilina - obtida da leguminosa pau-campeche) artificiais (eosina, azul de metileno) - são compostos aromáticos derivados da hulha denominados anilinas b) Quanto à caract. química: ácidos (EOSINA – COR ROSA) – básicos (HEMATOXILINA- COR ROXA) – DNA (ácido) neutros (ácidos e básicos) indiferentes (Sudam) c) Quanto ao emprego: citológico e histológico (são os que revelam elementos dos tecidos) . Ex: Orceína cora fibras elásticas d) Quanto ao método: progressiva (É a que se pratica sob controle ao microscópio até a obtenção do tom desejado) e regressiva (Faz-se uma super coloração e uma diferenciação - retirada do excesso de corante - com álcool ou ácido diluído) Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros * CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES e) Quanto ao número de cores Colorações monocrômicas – uma só cor é dada à estrutura. Ex: Corando-se um corte de órgão pela eosina prolongadamente, todas as estruturas tornam-se rosas. b) Colorações bicrômicas – duas cores diferentes. Ex. hematoxilina-eosina (núcleo da célula de roxo e o citoplasma de rosa). c) Colorações tricrômicas – cora o tecido com três cores fundamentais. Ex. Tricrômico de Gomori – usa-se a hematoxilina, cromotropo 2R e o Fast-Green, corando o núcleo de roxo, o citoplasma de vermelho e tecido conjuntivo de verde. * CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES 7 – MONTAGEM Material – entre lâmina e lamínula Permanentes – bálsamo do canadá – conserva a preparação M.E. – não tem permanentes após contraste, é observado e fotografado. * CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES 1 2 Coloração mono, bi ou tricromática? 3
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