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METODOS_DE_ESTUDO_EM_HISTOLOGIA

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Faculdade Barão do Rio Branco
Cidade Universitária
– HISTOLOGIA – 
MÉTODOS DE ESTUDO E DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
Prof. Sodré de Araújo Freitas
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NOÇÕES SOBRE OS NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO CORPO
O que é célula?
Menor porção do protoplasma que tem existência independente (diferentes formas e tamanhos).
 Tecido - agrupamento de células com mesma função
 Existem quatro tipos fundamentais de tecidos:
 Tecido epitelial – células que revestem superfícies, cavidades corporais ou formam glândulas; 
 Tecido conjuntivo – células e abundante matriz extracelular (preenchimento ou sustentação); 
 Tecido muscular – células com propriedades contráteis; 
 Tecido nervoso – células que formam o cérebro, medula nervosa e nervos.
 Órgãos - unidades funcionais maiores, constituídos por diferentes tipos de tecidos. 
 Ex: Esôfago: 
 tecido epitelial estratificado, 
 tecido conjuntivo,
 tecido epitelial glandular,
 tecido muscular.
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Sistemas de órgãos - compreendem vários órgãos com funções relacionadas.
Ex: Aparelho digestivo: 
 boca 
 língua 
 esôfago 
 estômago 
 intestinos 
 reto 
 ânus
Relação direta com outras disciplinas: Biologia celular, Citologia, Bioquímica, Fisiologia, Imunologia e Patologia  base para a compreensão dos processos patológicos e suas causas.
Pode ocorrer uma inter-relação entre os campos: Histofisiologia, Histoquimica, Imunohistoquímica, Histopatologia.
NOÇÕES SOBRE OS NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO CORPO
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NÍVEIS DE ORGANZAÇÃO DO CORPO 
ÁTOMOS
MOLÉCULAS
CÉLULAS
TECIDOS
ÓRGÃOS
SISTEMAS
ORGANISMO
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 Diferentes avanços técnicos têm permitido o desenvolvimento da pesquisa histológica. 
 É necessário conhecimento a respeito dos princípios fundamentais dos métodos aplicados à histologia.
 Métodos histológicos classificados em 2 grupos:
1- que se baseiam na observação direta das células e tecidos vivos,
2- que se baseiam em análise material morto ou inanimado.
MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA
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MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA
 Maior parte dos tecidos não observada in vivo 
Fixação (preserva estruturas morfológicas)
 Principais fixadores: formol, álcool etílico e ácido acético.
 Observação de tecidos ao microscópio ótico - por transparência.
Órgãos geralmente grandes – cortes finíssimos  diversas etapas  lâminas histológicas com preparados histológicos permanentes.
 Comum utilizar corantes (destacam determinadas partes das células, ex.: azul de metileno).
 Lâminas observadas ao microscópio óptico.
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MÉTODOS DE ESTUDO DE CÉLULAS E TECIDOS
ETAPAS:
1 – COLHEITA DO MATERIAL
2 – FIXAÇÃO
 
3 – INCLUSÃO
		
4 – MICROTOMIA
5- EXTENSÃO
			
6 – COLORAÇÃO 
7 – MONTAGEM 
 
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
1- COLHEITA DO MATERIAL
	Fragmentos de órgãos e tecidos a serem processados devem ser obtidos imediatamente após a morte do animal ou através de cirurgia a fim de evitar autólise.
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
2– FIXAÇÃO DO MATERIAL
É o tratamento da peça histológica a fim de que possa observar ao microscópio os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser vivo ( impedindo a destruição das células por suas próprias enzimas –autólise- ou bactérias)
Visa endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas subseqüentes da técnica histológica e pode ser feita por agentes físicos como calor ou por meios químicos.
A) Fixadores:
- Simples: formol, álcool etílico e metílico, ácido pícrico, ácido acético, ácido crômico, bicromato de potássio, etc.
Misturas fixadoras: 
*líquido de Zenquer - mistura bicromato sublimado-ácido acético; 
*líqudo de Bouin – mistura picro-formol-acética; 
*líquido de Fleming- mistura crômico-ósmio-acética;
*líquido de Helly - mistura bicromato-sublimato-formol.
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
b) Características de um bom fixador
	 - Rapidez de atuação; 
 - Poder de penetração e conservação das estruturas existentes in vitro;
 - Possibilitar o emprego subseqüente de técnicas adequadas ao estudo das estruturas.
c) Prática da Fixação:
Volume do fixador: + de 30 vezes o volume da peça.
Tempo de fixação: variável 
- Tratamento subseqüente do tecido: variável de acordo com o fixador empregado.
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
3 – INCLUSÃO
	Consiste em uma série de processos visando a feitura do bloco. 
 Parafina, celoidina, neve carbônica, etc.
Parafina (M.O.) – não mistura em água – desidratação
Resina (M.E.) – cortes ultra finos
Etapas da Inclusão em parafina:
Desidratação: passa-se o material em concentrações crescentes de álcool a 70%, 90% e absoluto.
2) Clarificação ou diafanização: o material é mergulhado em substâncias solventes de parafina. Ex: xilol, toluol, benzol, etc.
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
Etapas da Inclusão em parafina:
3) Penetração ou impregnação pela parafina: permitir a obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60°C, no interior da estufa. Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza.
4) Inclusão definitiva: é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada à temperatura ambiente, dá origem ao chamado “bloco de parafina”. A inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epóxi, sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica. 
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
4) MICROTOMIA
	- Reduzir os tecidos a cortes finíssimos.
 - Os cortes são realizados em aparelhos especiais chamados micrótomos, dos quais existem modelos para inclusão em parafina, celoidina e congelação. 
 - Os cortes mais utilizados são os de 5 a 7 μm de espessura. (1 um = 0,001 mm) 
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MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 
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EXTENSÃO
	- os cortes provenientes da microtomia são “enrugados”. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58°C, e “pescados” com uma lâmina. Leva-se então, à estufa a 37°C, por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina contida na água quente.
5- EXTENSÃO
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6- COLORAÇÃO E 7- MONTAGEM
	- Para Microscopia óptica convencional, os cortes são cortados com uma lâmina de aço inoxidável e montados em uma lâmina de vidro revestida pelas com um adesivo.
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ETAPAS DA TÉCNICA HISTOLÓGICA 
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5- COLORAÇÃO
a) Quanto à origem: naturais (carmim, hematoxilina - obtida da leguminosa pau-campeche) 
 artificiais (eosina, azul de metileno) - são compostos aromáticos derivados da hulha denominados anilinas
b) Quanto à caract. química: ácidos (EOSINA – COR ROSA) –
 básicos (HEMATOXILINA- COR ROXA) – DNA (ácido) 
 neutros (ácidos e básicos)
 indiferentes (Sudam)
c) Quanto ao emprego: citológico e histológico (são os que revelam elementos dos tecidos) . Ex: Orceína cora fibras elásticas
d) Quanto ao método: progressiva (É a que se pratica sob controle ao microscópio até a obtenção do tom desejado) e regressiva (Faz-se uma super coloração e uma diferenciação - retirada do excesso de corante - com álcool ou ácido diluído)
Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros 
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CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES
e) Quanto ao número de cores
Colorações monocrômicas – uma só cor é dada à estrutura.
Ex: Corando-se um corte de órgão pela eosina prolongadamente,
todas as estruturas tornam-se rosas.
b) Colorações bicrômicas – duas cores diferentes.
Ex. hematoxilina-eosina (núcleo da célula de roxo e o citoplasma de rosa).
c) Colorações tricrômicas – cora o tecido com três cores fundamentais. 
Ex. Tricrômico de Gomori – usa-se a hematoxilina, cromotropo 2R e o Fast-Green, corando o núcleo de roxo, o citoplasma de vermelho e tecido conjuntivo de verde.
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CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES
7 – MONTAGEM
Material – entre lâmina e lamínula
Permanentes – bálsamo do canadá – conserva a preparação
M.E. – não tem permanentes  após contraste, é observado e fotografado.
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CLASSIFICAÇÃO DOS COLORAÇÕES
1
2
Coloração mono, bi ou tricromática?
3

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