P1 - 2006

Prévia do material em texto

PROVA 1 - BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL – QBQ 316 – 2º SEMESTRE/2006 
 
 
Questão 1 – Um lisado (10mL) do fungo Trichoderma reseei foi submetido a uma 
cromatografia de troca iônica na coluna DEAE-celulose para purificação de uma alfa-
glicosidase. Nesta cromatografia foram utilizados dois tampões: A) Fosfato de sódio 50 
mM pH 7,0 B) Fosfato de sódio 50 mM pH 7,0 contendo NaCl 1M. 
A tabela 1 traz as condições de ensaio e os resultados da determinação de atividade de alfa-
glicosidase no lisado inicial. Neste ensaio p-nitrofenil alfa glicosídeo 4 mM preparado em 
tampão citrato-fosfato 100 mM pH 6,0 foi utilizado como substrato. A concentração de 
proteína total deste material era de 10 mg/mL e uma alíquota de 2 mL foi submetida à 
cromatografia. 
 
Tabela 1 – Ensaio de alfa-glicosidase no Lisado inicial
tubo volume de volume de tempo de Tampão absorbância
 lisado substrato incubação (min) carbonato em 420nm 
1 0,1 ml 0,1 ml 5 0,5 ml 0,2 
2 0,1 ml 0,1 ml 10 0,5 ml 0,9 
3 0,1 ml 0,1 ml 15 0,5 ml 0,6 
4 0,1 ml 0,1 ml 20 0,5 ml 0,8 
 
Durante a cromatografia de troca iônica foi coletado um total de 20 frações, cada uma delas 
continha 0,25 mL. O ensaio de atividade de alfa-glicosidase revelou que apenas as frações 
12, 13, 14 e 15 eluídas após a adição de tampão com NaCl 1M continham alfa-glicosidase. 
Todas estas frações foram reunidas em um único tubo que passou a ser denominado 
“material TI”. Uma determinação pelo método de Bradford mostrou que a concentração de 
proteína total deste material era 1 mg/mL. 
Além disso, o material TI foi utilizado para determinação da atividade de alfa-glicosidase. 
A tabela 2 traz as condições de ensaio e os resultados obtidos neste experimento. Neste 
ensaio p-nitrofenil alfa glicosídeo 4 mM preparado em tampão citrato-fosfato 100 mM pH 
6,0 foi utilizado como substrato 
 
 
Tabela 2 – Ensaio de alfa-glicosidase no material TI
tubo volume de volume de tempo de Tampão absorbância 
 lisado substrato incubação (min) Carbonato em 420nm 
1 0,1 ml 0,1 ml 5 0,5 ml 0,1 
2 0,1 ml 0,1 ml 10 0,5 ml 0,2 
3 0,1 ml 0,1 ml 15 0,5 ml 0,9 
4 0,1 ml 0,1 ml 20 0,5 ml 0,4 
 
Com base nestas informações determine: 
a - a recuperação da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
b – o enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
c – qual a provável faixa de valores do ponto isoelétrico desta alfa-glicosidase 
 
 
 1
 
 
DADO: 
a)Tabela 3 – Relação entre micromols de p-nitrofenolato e sua absorbância em 420nm 
 
micromols 
absorbância 
420nm 
de p-nitrofenolato 
2 0,2 
4 0,4 
6 0,6 
8 0,8 
10 1 
 
Diferentes quantidades de p-nitrofenolato (micromols) foram solubilizadas em 0,2 mL de 
água e sua absorbância determinada em 420nm após a adição de 0,5 mL de tampão 
carbonato 200 mM pH 11 
 
 
b) A coluna DEAE-celulose tem uma matriz positivamente carregada na faixa de pH 
de 2 a 11. 
 
c) 1 U (uma unidade) de atividade enzimática equivale a quantidade de enzima que 
catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 micromol de produto 
por minuto 
 
 
 
 
Questão 2 – Um aluno fez dois ensaios para detecção de atividade enzimática de alfa-
glicosidase. No primeiro ensaio o lisado de células de levedura foi diluído 20 vezes, 
enquanto que no segundo ensaio a diluição usada foi de 2 vezes. Abaixo seguem as 
condições de ensaio e resultados. 
Baseando-se nestes dados responda: 
a) Qual a concentração de atividade enzimática de alfa-glicosidase no lisado de 
levedura? Apresente gráficos e cálculos para justificar a resposta. 
b) Os resultados obtidos nas duas diferentes diluições são coerentes entre si? Justifique 
sua resposta explicando os resultados obtidos. 
 
Condições do ensaio 
Substrato: p-nitrofenil alfa-glicosídeo 4 mM preparado em tampão citrato-fosfato 50 mM 
pH 6 
Enzima: Lisado de levedura preparado em tampão fosfato 20 mM pH 7 
Ensaio: 0,2 mL de lisado diluído (20vezes ou 2vezes) + 0,2 mL de substrato 
Incubação a 30°C por diferentes intervalos de tempo. Interrupção com tampão carbonato-
bicarbonato 
Equação da curva-padrão de p-nitrofenolado: y = 0,0061 + 0,0097 
 2
Resultados experimentais 
 lisado 20x lisado 2x 
tempo (min) abs. 420nm abs. 420nm 
5 0,107 0,986 
10 0,205 1,718 
15 0,303 2,206 
20 0,400 2,694 
 
 
 
 
 
Questão 3 – Uma alfa-glicosidase foi submetida a uma filtração em gel em uma coluna que 
tinha um volume total de 25 mL. Nesta cromatografia foi utilizado um tampão citrato-
fosfato 50 mM pH 6,0 e foram coletados 50 tubos (frações) contendo cada um deles 0,5 mL 
do material eluído da coluna. Estes tubos posteriormente foram usados para detecção da 
atividade de alfa-glicosidase empregando-se como substrato p-nitrofenil alfa glicosídeo 4 
mM. Nestas condições a atividade de alfa-glicosidase foi encontrada no tubo 24. 
Esta mesma coluna foi previamente calibrada com uma mistura de proteínas padrão, tendo 
sido obtidos os resultados da tabela abaixo: 
 
Tabela 1 - Volumes de eluição na cromatografia de filtração em gel. 
Material Volume de eluição (mL) 
Proteína padrão de 2.000.000 daltons 7.53 
Proteína padrão de 66.000 daltons 9.38 
Proteína padrão de 45.000 daltons 10.46 
Proteína padrão de 12.400 daltons 13.70 
Proteína padrão de 6.500 daltons 16.22 
 
Com base nestas informações calcule o peso molecular relativo desta alfa-glicosidase. 
 
 
 
 
 
Questão 4 - Os gráficos abaixo representam o efeito do pH sobre a velocidade de uma 
reação enzimática, onde se mediu a concentração de produto formado durante 5 min. Para 
a curva A, se mediu a velocidade nos pHs indicados. Para a curva B a enzima foi pré-
incubada durante 10 min nos pHs indicados e depois a velocidade foi medida para todos os 
tubos em pH 7,5, medindo-se a concentração do produto formado durante 5 min. 
 3
B
v 
(n
m
ol
s.
m
in
-1
)
0
1
2
3
4
5
6
A
pH
2 3 4 5 6 7 8 9 10
v 
(n
m
ol
s.
m
in
-1
)
0
1
2
3
4
5
6
B
 
a) abaixo do pH ótimo, qual seria a causa principal que determinaria a diminuição da 
velocidade da reação? 
b) acima do pH ótimo, qual seria a causa principal que determinaria a diminuição da 
velocidade da reação? 
c) proponha uma hipótese para explicar porque a curva A não é simétrica. 
 
 
 
Questão 5 – Foram preparados três lisados de levedura com uma volume total de 5 mL, os 
quais foram utilizados para determinação da concentração de proteína total através do 
reagente de Bradford (Coomassie Blue G). Com base nos dados dos experimentos abaixo 
indique qual destes lisados contêm a maior concentração de proteína total. 
 
Experimento 1: 
Usando uma solução de albumina 1g/L foram preparados os tubos abaixo 
Tubo Solução de 
albumina 
(μL) 
Água 
(μL) 
Reagente de 
Bradford 
(mL) 
Absorbância em 595nm após 5 min 
de incubação 
1 0,05 99,5 1 0,002 
2 1 99 1 0,001 
3 2 98 1 0,1 
4 4 96 1 0,18 
5 6 94 1 0,32 
6 8 92 1 0,4 
 4
7 10 90 1 0,51 
8 12 88 1 0,6 
9 14 86 1 0,7 
10 16 84 1 1,7 
11 18 82 1 0,9 
12 20 80 1 1 
13 30 70 1 1,02 
14 40 60 1 1,05 
 
 
Experimento 2 
Usando os três diferentes lisados foram preparados os tubos abaixo. Atente para o fato de 
que os diferentes lisados passaram por diferentes diluições antes de serem colocados nos 
tubos. 
Tubo 
 
Lisado A (mL) 
Diluição 
prévia 
Reagente de 
Bradford 
(mL) 
Absorbância em 
595nm após 5 min de 
incubação 
1 0,1 Sem diluir 1 2 
2 0,1 2x 1 0,55 
 
 Lisado B (mL) 
3 0,1 5x 1 0,32 
4 0,1 10x 1 0,15 
 
 Lisado C (mL) 
5 0,1 Sem diluir 1 0,32 
6 0,1 200x 1 0,01 
 
 5