GENÉTICA I - Aula Do DNA ao Fenótipo 2015

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Do DNA ao Fenótipo
Profa. Vanessa Kava
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Pigmentos
coloridos
Substrato
Função enzimática
Tradução
Processamento
Transcrição
DNA
hnRNA
mRNA
Proteína
Expressão do Gene para Cor da Flor
Replicação do DNA
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Replicação do DNA
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 1953 - 5 semanas após a publicação do trabalho da estrutura do DNA,
Watson e Crick publicaram outro trabalho propondo uma forma de
replicação do DNA - REPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA
 1958 - Experimento de Matthew Meselson e Franklin Stahl comprova
o modelo de replicação semiconservativo em E. coli.
Replicação do DNA
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Experimento de Meselson e Stahl (1958)
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Replicação do DNA Replicação do DNA - Procariotos
 1961 – John Cairns provou que o
cromossomo de E. coli continha uma
única molécula de dupla hélice de DNA.
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Visualização de cromossomo bacteriano
replicando: John Cairns (1963)
(autorradiografia)
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11 12
Origem de replicação em E. coli
OriC:
- 245 pares de nucleotídeos,
- 2 sequências repetidas e
conservadas
- uma sequencia de 13pb (3
repetições in tandem) rica em AT,
bolha de replicação
-uma sequencia de 9pb, repetida 4
vezes (sítio de ligação de proteína
para a bolha de replicação)
-Vírus e bactérias: geralmente uma
origem de replicação
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Replicação semi-conservativa e
bidirecional
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Etapas da Replicação
 Iniciação: proteínas iniciadoras ligam-se a
oriC e fazem com que um trecho curto de
DNA se desenrole.
 Deselicoidização:
 as helicases de DNA quebram as
pontes de hidrogênio e continuam a
deselicoidização, movendo a forquilha
de replicação.
 As proteínas de ligação unifilamentar
(SSB – “single-strand-biding proteins”)
estabilizam o DNA unifilamentar.
 A DNA girase (topoisomerase) reduz a
força torcional que se acumula adiante
da forquilha de replicação.
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Etapas da Replicação
 Alongamento:
 A primase sintetiza um trecho curto de
nucleotídeos de RNA (primers 10 a 12
nucleotídeos) que fornece uma extremidade
3’ – OH para começar a síntese de DNA.
 Síntese: Desoxirribunocleotídeos são
adicionados pela DNA polimerase III .
 Remoção e substituição dos primers por
DNA pela DNA polimerase I
 Ligação dos fragmentos de Okasaki pela
DNA ligase
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Etapas da Replicação
 Término:
 Procariotos: DNA circular, quando as duas
forquilhas de replicação se encontram ela termina.
 Eucariotos: sequências de nucleotídeos específicas
no final dos cromossomos, incorporadas a
telômeros.
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Revisão pela atividade de exonuclease
(3’ 5’) das DNAs polimerases
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PONTOS IMPORTANTES
 A síntese de DNA
Ocorre no sentido 5’ 3’ (novos nucleotídeos são
sempre adicionados à ponta 3’ do filamento crescente de
nucleotídeos
 Síntese do filamento leading - contínua
 Síntese do filamento lagging – descontínua (fragmentos
de Okasaki)
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Aspectos da replicação de cromossomos
eucarióticos
 Em geral, semelhantes a procariotos
 Fragmentos de Okasaki são mais curtos em eucariontes
(100 a 200 pb) do que em procariontes (1000 a 2000 pb)
 Duas ou três DNA polimerases estão presentes em cada
forquilha de replicação
 Síntese de DNA ocorre em uma pequena parte do ciclo
celular (S)
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Origem de replicação em eucariontes
 Várias origens de replicação, aparentemente em
locais específicos (chegando a milhares)
 Sequências específicas
 Saccharomyces cerevisiae
 Segmentos de DNA cromossômico que permitem um
fragmento de DNA circular replicar-se autonomamente
 Elementos ARS (Sequência de Replicação Autônoma)
 ARS tem cerca de 50 pb, tem uma sequência de 11 pb
rica em A-T
A T T T A T Pu T T T A
T A A A T A Pi A A A T
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Elementos ARS
(Sequência de Replicação Autônoma)
 Frequência de elementos ARS em S. cerevisiae coincide
com o número de origens de replicação
 Alterações na região conservada (11pb) acabam com a
capacidade de replicação
 Tentativas de caracterizar as origens de replicação em
eucariontes multicelulares foram infrutíferas (os
componentes de uma origem funcional ainda não estão
claros, podem ser sequências longas com até milhares
de pares de bases)
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Aspectos da replicação de cromossomos
eucarióticos
 Cromossomos com múltiplas origens de replicação
(sistema mais rápido)
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Molécula de DNA de D.
melanogaster mostrando 4
forquilhas de replicação
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Aspectos da replicação de cromossomos
eucarióticos
 Nucleossomos e as forquilhas de replicação (grande
síntese de histonas, principalmente na fase S)
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Replicação
 É semiconservativa
 É iniciada em origens únicas
 Geralmente é bidirecional
 É muito rápida
 ~3.000 nucleotídeos por minuto em
humanos (500 a 5.000 em eucariotos)
 ~30.000 nucleotídeos por minuto em
bactérias (pode chegar até 1.000
nucleotídeos por segundo!)
 Apesar da rapidez, apresenta grande
precisão (menos de um erro por um
bilhão de nucleotídeos – mecanismos
de revisão e de reparo)
Replicação
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Transcrição e
Processamento do RNA
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Transcrição: História
 Ao se desvendar a estrutura da molécula de DNA o
princípio da replicação pôde ser visualizado sem
dificuldades
 No entanto, a forma com que as proteínas eram geradas
a partir desta molécula informacional permanecia um
mistério
 Particularmente Crick, que já postulava a existência de
uma molécula intermediária para estabelecer a
complementaridade necessária entre as bases dos
ácidos nucleicos e os aminoácidos das proteínas
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RNA e Síntese de Proteínas
 Inicialmente não havia conhecimento sobre qualquer
conexão entre o processo de síntese proteica que
ocorre no citoplasma e a molécula de DNA presente
no núcleo (eucariotos)
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RNA e Síntese de Proteínas
 Evidências de que a síntese de proteínas era
mediada pelo RNA e não pelo DNA:
 Existência de um tipo de RNA que transportava
aminoácidos (tRNA).
Ocorrência de síntese proteica nos ribossomos
localizados no citoplasma da célula eucariótica,
portanto, separado do DNA, que se encontra no
núcleo.
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RNA e Síntese de Proteínas
 Utilizando a técnica de hibridização, Hall & Spiegelman
(1961) demonstraram que o DNA agia como molde para
a síntese de moléculas instáveis de RNA e que havia
uma correlação entre o aumento de RNA instável e
síntese proteica.
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RNA e Síntese de Proteínas
 Em trabalho publicado em 1961 (Brenner et al.)
assumiu-se que a espécie instável de RNA era
responsável por carregar a mensagem contida na
molécula de DNA até os ribossomos
Denominada RNA mensageiro (mRNA)
 Finalmente estabelecia-se uma conexão entre genes e
proteínas
 Via uma molécula instável de RNA, cuja síntese e degradação
podia ser perfeitamente regulada pela célula em resposta a suas
necessidades.
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Tipos de RNA
 RNA mensageiro (mRNA):
 Transcreve uma das fitas de DNA;
 Transporta a informação do núcleo ao citoplasma.
 RNA ribossômico (rRNA):
 Associado à tradução da mensagem genética na síntese
proteica.
 RNA transportador (tRNA):
 Moléculas pequenas de RNA com 73 a 93 nucleotídeos
que funcionam como receptores e transportadores de
aminoácidos;
 Existe um tRNA para cada um dos 20 aminoácidos.
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Transcrição do DNA
• Quando se escreve uma sequência de nucleotídeos
correspondente a um gene, sempre é representada a fita
codificadora
• A sequência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'
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Transcrição
 A síntese de qualquer dos tipos de molécula de RNA é
catalisada pela enzima RNA polimerase
 Comparando os processos de transcrição e replicação do
DNA:
Durante a replicação, o cromossomo inteiro é copiado,
produzindo-se fitas filhas idênticas às originais
Durante a transcrição, apenas segmentos selecionados
de uma das fitas do DNA são utilizados como molde
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A Unidade de Transcrição A transcrição de um segmento
se inicia quando a RNA
polimerase reconhece e liga-se
a sequências específicas de
nucleotídeos em uma região
especial, no início do gene,
denominada promotor
 A partir daí a RNA polimerase
move-se ao longo do molde,
sintetizando RNA, até alcançar
uma outra sequência
específica que sinaliza o
término da transcrição
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TRANSCRIÇÃO
 procariotos : os processos de transcrição e tradução
podem ser acoplados, antes mesmo de terminar a
transcrição a tradução já se inicia
 Em geral, os mRNAs de procariotos não sofrem
modificações
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TRANSCRIÇÃO
 Eucariotos:
Os processos de transcrição e tradução estão
temporal e espacialmente isolados (a transcrição do
DNA ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma)
Os transcritos primários que originarão mRNAs, na
sua migração do núcleo para o citoplasma, sofrem
extensiva modificação antes de atravessarem a
barreira imposta pela carioteca
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Processamento Pós-Transcricional - eucariotos
 As modificações que ocorrem nos transcritos nucleares
são, basicamente de três tipos:
 Coroamento ("capping") do terminal 5‘ (adição de 5’
metilguanosina);
 Poliadenilação do terminal 3‘ (cauda Poli A);
 Montagem de segmentos codificadores ("splicing")
(hnRNA: RNA heterogêneo nuclear ou pré-mRNA)
 Este conjunto de modificações no transcrito nuclear
originará o mRNA, pronto para migrar para o citoplasma
 Transcritos originados na mitocôndria ou cloroplastos
não sofrem tais modificações, comportando-se de forma
similar aos de bactérias
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Sítios de splicing
Splicing
DNA
Transcrição
mRNA
intron
exon
Pré-mRNA
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Splicing do mRNA
 Philip Sharp & Richard Roberts (1977): A descoberta de
que os genes de eucariotos poderiam ser interrompidos
ou fragmentados (prêmio Nobel de 1993)
 Posteriormente, foram detectados genes interrompidos
também em bactérias, porém como um evento raro
 O processo de remoção dos introns e união dos exons
ocorre via reações altamente específicas, em pontos de
junção definidos, para garantir que a mensagem contida
na sequência de nucleotídeos dos exons não seja
alterada durante a montagem
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Processamento do pré-mRNA transcrito do gene
da ovoalbumina de galinha
Adição de Capacete (G – CH3 5’ metilguanosina)
Adição de Cauda (poli – A)
Retirada de Íntrons e União de Éxons
5’ 3’
Capacete Sequência
que Codifica
Cauda
RNA mensageiro (mRNA)
5’ 3’
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7
Éxons
Íntrons
pré-mRNA ou RNA heterogêneo nuclear (hnRNA)
 Processamento alternativo
Tireóide Cérebro
Hormônio Calcitonina Peptídeo CGRP
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Tradução e o
código genético
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Tradução - Síntese de proteínas
 RNAm final (maduro)
 RNAt
 Ribossomos
 Aminoácidos
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Informação genética:
 É escrita em um alfabeto de apenas 4
letras
A, T, G, C
 É expressa diferencialmente durante o
crescimento e desenvolvimento do
organismo
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49
Tradução: História
 Em 1954, o astrofísico George Gamow, tomando
conhecimento dos trabalhos de Watson & Crick, sobre
estrutura e replicação do DNA, propôs que os quatro
tipos de bases sequencialmente dispostos na molécula
de DNA constituiriam as letras de um código
 Este código comandaria a sequência dos aminoácidos nas
proteínas
 A questão inicial era descobrir como o sistema de 4
bases estava organizado para sinalizar aos 20 tipos de
aminoácidos que participam das proteínas
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 De 1954 a 1966, intensas discussões e
experimentações foram realizadas por todos aqueles
que se interessavam pelo assunto
 Finalmente, os trabalhos realizados por Nirenberg &
Leder (1964) e por Khorana e colaboradores (1966),
desvendaram por completo o código genético.
Tradução: História
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Código Genético
 A unidade básica (códon) do código para um aminoácido
consiste em uma sequência de três pares de bases
nucleotídicas (códon de trincas)
 O código genético também inclui sequências para o início (códon
iniciador) e para o término (códon finalizador) da região
codificadora
 O código genético é universal: os mesmos códons são
utilizados por diferentes organismos
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Código Genético
 Código Genético  mapeamento dos
códons dos aminoácidos
64 códons
20 aminoácidos
3 códons de parada
aminoácidos mapeados por mais
de um códon
Degeneração do código genéticoDegeneração do código genético
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CÓDIGO GENÉTICO
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Propriedades do Código Genético
 Unidade constituída de três letras;
 Tem ponto inicial;
 Não é sobreposto;
 É degenerado;
 Não é ambíguo;
 É universal (quase);
 Tem ponto final.
10
55
50 S
30 S
5’ 3’
mRNA
70 S
Início da tradução
NH3+
Final da tradução
Tradução – Síntese de Proteínas
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5’
5’
3’
3’
Peptidil - tRNA
tRNA
descarregado
Tradução – Síntese de Proteínas
3’5’
Sítio
A
Polipeptídeo
Último tRNA
Sítio A vazio
5’ 3’
5’ 3’
57 58
59
•A mutação é a fonte básica de variabilidade
genética.
•A mutação fornece a matéria-prima para a
evolução.
60
Mutação
11
Mutações
 Alterações herdáveis de uma célula ou organismo.
 A taxa de mutação média em um gene é de 10-6.
 O tamanho médio de um gene é de 1000 pb.
 Então a taxa de mutação média por nucleotídeo é de 10-9.
 Se ocorressem com mais frequência desestabilizariam a
transmissão da informação genética de uma geração a
outra.
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Mutações de ponto
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Efeitos no DNA:
Alteram um ou poucos pares de bases do DNA
Substituição de bases
Um par é substituído por outro:
•Transições: Purina – Purina – A-G
Pirimidina – Pirimidina – C-T
•Transversões: Purina – Pirimidina – A-T
Pirimidina – Purina – T-G
63 64
•Adições/inserções
•Microdeleções/deleções
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Mutação silenciosa
Alteração no DNA produz um códon sinônimo o mesmo
aminoácido
CGC = Arginina
CGA = Arginina
PROTEÍNA NÃO
ALTERADA
Detecção apenas por análise molecular
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Mutação Sinônima
Há mudança para um aminoácido diferente, mas funcionalmente
equivalente
AAA AGA
Lisina básica para Arginina básica
Proteína com função normal
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Mutação de sentido
trocado (não sinônima)
Substituição de aminoácido na
proteína
Alteração na
estrutura e função
da proteína
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Mutação sem sentido
Mudança para um códon que
codifica término de cadeia
UAC  UAG
Códon de parada prematuro
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Mutação por adição ou deleção de um só par de
nucleotídeos
ou
Mutação por adição ou deleção de pares de bases
em número que não seja múltiplo de 3
Mudança na matriz de leitura
Proteína com toda a sequência de
aa alterada - perda de função
70
Correto
71 72
13
Mutações gênicas
Alelo selvagem Alelo nulo
Alelo leaky
Alelo com ganho de
função
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Origem das mutações
Mutações espontâneas
Erros na duplicação do DNA
 Lesões espontâneas
Expansão de trinucleotídeos
Mutações induzidas
Agentes mutagênicos
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“We totally missed the possible role of...[DNA] repair
although...I later came to realise that DNA is so precious
that probably many distinct repair mechanisms would
exist.”
Francis Crick, Nature 26 abril 1974.
75