Apostila de Fotocolorimetria

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERtVAlVIBUCO
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Biofísica e Radiobiologia
PRÁTICA DE FOTOCOLORIMETRIA
Prof. Milton Marcelino Filho
Recife, 2004
SUMÁRIO
1 - rf,rTRO])UÇÃO , 2
2 - FIJNDA"l\1ENTOS TEÓRICOS ............................................................................................•......... 2
3 - O EQUIPAMENTO 2
3. 1 - FOTOCOLORÍMETRO , 2
3.1.1-FontedeLuz 2
3.1.2 - Filtro 2
3.1.3 - Cubeta 2
3.1.4 - Fotocélula : : ~ ~ 2
3.1.5 - Miliamperímetro " ?
3.2 - ESPECTROFOTÔMETRO : 2
4 - Ul~rr.,IZA..ÇÃO DO FOTOCOLORÍlVIETRO , 2
4.1 - ASPECTO EXTERNO DO FOTOCOLORÍMETRO 2
4.2 - RELAÇÃO MATEMÁTICA ENTRE ABSORBÂNCIA E TRANSMIT.ÂNCIA 2
4.3 - CJ>JJBRAÇAO DO APARELHO : 2
5 --PltOCE][)IMENTO PRÁTICO 2
5.1 - PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES 2
5.2 - CONSTRUÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO : 2
5.3 - CONSTRUÇÃO DA.CUR VA PADRÃO 2
5.4 - UTILIZAÇÃO DA. CURVA PADRÃo 2
6 - ClllDADOS A SEREM OBSERVADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 2
7 - DI:sCUSS.~O ~.............................................................................................................•. , 2
8 - B1JBLIOGRAFIA ................•........................... ,..........................................................•..................... 2
I
I
1
A fotocolorimetria é um método biofisico dJ análise de substâncias largamente utilizado em
laboratórios de análises clínicas e em laboratórior de pesquisa, tendo como principal objetivo a
determinação da concentração de soluções.
Este método baseia-se na relação existente entre a absorção de radiações elet.romagnéticas
(luz) e a concentração da substância em questão. Sabemos, através da nossa experiência cotidiana,
que quanto mais concentrada urna solução mais escura ela se apresenta, ou seja, maior é a quantidade
de luz absorvida pela solução.
1 - INTRODUÇÃO
2 - FUNDAMENTOS TEÓRICOS
2
Estudos experimentais realizados por Lambert e Beer demonstraram que existe uma relação
direta E) exponencia! entre a concentração de uma solução e a luz por ela absorvida, ou seja, tomando-
se dois recipientes iguais, transparentes, contendo a mesma substância em solução, porém com
concentrações diferentes (C1 e C2), sendo C2 > C1, observa-se que a intensidade deluz emergente do
recipiente 2 (12) é menor do que a intensidade de luz que emerge do recipiente 1 O;).
d, = d,
e
C, > c,
10 = intensidade de luz incidente
h e 12 = intensidade de luz emergente
C, e C2 = concentração da solução
di e d2 = percurso óptico
Fig. 1: Absorção de luz em função da concentração da solução.
Lambert e Beer, também demonstraram que dados dois recipientes transparentes contendo a
mesma solução em concentrações iguais (C3 = C4), sendo o recipiente 4 maior que o recipiente 3, a
intensiclade de luz emergente do recipiente 4 (14) será menor que a intensidade de luz que emerge do
recipiente 3 (b). Assim, a luz.emergente depende também do percurso óptico, ou seja, distância
percorrida pela luz através da solução.
c, = C.
e
d, > o,
•',< "
10 = intensidade de luz incidente
13 e, 14 = intensidade de luz emergente
C3 e C4 = concentração da solução
d3 e d, = percurso óptico
Fig. 2: Absorção de luz em função do percurso óptico.
3
A partir dos experimentos descritos, os 'pesquisadores chegaram à seguinte equação, conhecida
como Lei de Larnbert-Beer:
(eq. 1)
Esta equação relaciona a luz emergente de uma solução (I) com a intensidade luminosa
incidente (Is), a sua concentração (C), o percursoóptíco (d) e uma constante ele absorção (k), que é
característica de cada substância.
3 - O EQUIPAMIENTO
3.1 - FOTOCOLORíMETRO
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A figura 3 apresenta um diagrama em blocos de .um fotocolorímetro. Em seguida são descritos
detalhadarnente os seus diversos componentes.
I
I
I
L
J
'·1. ,
< I
Luz branca
(policromática)
~
r==)
Luz rnonocrornática
1
Fotocélula
I
~
Fonte
de luz
Filtros Cubeta
Fig. 3: Diagrama em blocos de um fotocolorímetro.
3.1.1 - Fonte de Luz
A fonte de luz deve apresentar como principais características a estabilidade na intensidade
emitida e um espectro de emissão adequado.
É utilizada uma lâmpada de filamento de tungstênio alimentada por uma tensão proveniente de
um circuito regulador de voltagem. Este circuito fornece uma voltagem constante independentemente
de variações na tensão de alimentação do equipamento (oscilações na rede de distribuição de energia
elétrica) e independentemente da temperatura ambiente. A utilização deste circuito é necessária pois a
lurninosidade emitida pelas lâmpadas de filamento depende da tensão a que elas estão submetidas.
Em relação ao espectro de emissão é necessário que a lâmpada emita luz branca, ou seja,
todos os comprimentos de onda do espectro de luz visível, figura 4.
4
3.1.2 - Filtro
Através de filtros ópticos é possível retirar (separar) desta luz branca as diferentes cores (luz
monocromática) que a constituem. Sendo que cada cor corresponde a uma faixa de comprimento de
onda (À) do espectro de radiações eletrornaqnéticas.
A banda passante típica de um filtro de vidro é de 50 nm, o que significa dizer que não é
possível selecionar faixas do espectro da luz visível com largura inferior a 50 nm.
Luz visível
Raios y
Q)
s "E
1i! ~
Raios X UV IV Microondas Ondas de rádio
I ~-1====~~==~i-~~;:~~~~~~~~~
1 pm 1 nm 400 nm 750 nm 25 11m 1 mm A
Fig. 4: Espectro de radiação eletromagnética em ordem crescente de seus comprimentos de onda
(À), pm = 10-12 m, nm = 10-9 m; ~m = 10-6 m; mm = 10-3 m. ;....•.
o espectro de radiação eletromagnética inclui os raios gama, os raios x, o ultravioleta, a Iuz
visível, o infravermelho, as microondas e as ondas de rádio. Esses nomes indicam áreas do espectro,
divididas com fins didáticos e práticos, entretanto o espectro é contínuo e não há diferenças marcantes
entre as diversas regiões. Exceto pelas diferenças nos comprimentos de ondas, que estão associadas a
diferentes níveis de energia da radiação, conforme equação 2.
E
h .c
Â
(eq.2)
Onde E é a energia da onda eletromagnética, h é a constante de Plank, C é a velocidade da luz
e  é o comprimento de onda da radiação.
Estes diferentes níveis de energia acarretam diferentes características, como o poder de
penetração dos raios X ou o aquecimento do infravermelho. No mais apresentam propriedades que Ihes
são comuns como, por exemplo, propagação pelo espaço com a mesma velocidade (300 mil km/s),
conhecida como "velocidade da luz", sofrem reflexão, refração, difração e interferência.
3.1.3 - Cubeta
O recipiente onde se coloca a solução a ser analisada, chama-se "cubeta". No caso do
fotocoiorimetro utilizado na aula prática a cubeta de medição tem a forma de um tubo de ensaio, tendo
as cirnensôs.s compatíveis com o porta-cubetas (receptáculo que aloja a cubeta) e é confeccionada com
um vidro especial.
Como a luz que se transmite através da cubeta não é uniformemente absorvida, ou seja, o vidro
não é perfeitamente homogêneo, o fabricante marca a cubeta com um risco na parte superior da cubeta
com o objetivo de padronizar a luz absorvida pelo vidro da cubeta e eliminar possíveis variações das
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leituras de amostras, colocadas em diferentes cubetas. Este risco existente na cubeta deve coincidir
com a marca no porta-cubetas.
Fig. 5: Cubeta e porta-cubetas ressaltando a posição de colocação.
A forma e as dimensões da cubeta variam com a marca e o modelo do equipamento, podendo
ser quadradas, retangulares ou cilíndricas. Além do vidro também utilizam-se cubetas descartáveis de
polistireno e acrílico. Cubetas de quartzo são utilizadas nos espectrofotõrnetros (descrito no sub-itern
3.2, pág. 5), que operam na região do ultravioleta. A figura 6 mostra alguns exemplos de cubetas ..
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