relatorio da pratica 1 - enzimas

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Universidade de Caxias do Sul – UCS
Departamento de Ciências Exatas e Tecnologia
Curso de Engenharia Ambiental
Disciplina: Bioquímica aplicada à Engenharia Ambiental
Relatório da Aula Prática 1 – Enzimas
Autor:
Pedro Nahorny Pezzi
Profa.: 
Eloane Malvessi
Caxias do Sul, RS.
Agosto, 2013
Introdução
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular1. Nesta aula prática fizemos três experimentos com enzimas:
Hidrólise com amilase salivar
Degradação de corante por Pleurotus sajor-caju
Prova da catalase com as culturas de Staphylococcus aereus e E. coli.
Objetivo (s) da aula prática
Experimentos com enzimas podem ter vários objetivos. O primeiro deles diz respeito às funções do organismo ou da célula. Ao se constatar a existência de alguma enzima num organismo, o próprio passo será o de verificar o contexto no qual a reação que ela catalisa se insere. Quase sempre a reação faz parte de alguma via metabólica. O estudo da regulação, da localização e das demais características da etapa catalisada por esta enzima e pelas demais enzimas da via perfazem um detalhe importante no entendimento da fisiologia do organismo ou célula em questão. Os processos analíticos podem ser de interesse para a indústria, a pesquisa científica, ou, aspecto muito importante, para o diagnóstico médico2. Aprendemos também: o manuseio dos instrumentos e de aparelhos do Laboratório, a atividade foi realizada em grupos levando fazendo com que houvesse uma interação e construção de uma amizade entre os colegas.
Procedimentos utilizados 
Antes de efetuar os experimentos, foi necessário conhecer os materiais e os equipamentos existentes no laboratório. Seguido de procedimentos práticos para que se possa saber manusear (pipetar, filtrar, etc.) os instrumentos existentes no laboratório, assim como, saber manusear com tubos de ensaio, pipeta Pasteur (conta-gotas), placas, etc.
Hidrólise com amilase salivar 
A saliva possui uma enzima chamada amilase salivar, que quebra as moléculas de amido em glicose. A amilase salivar é uma enzima que atua provocando a hidrólise do amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substância de armazenamento.
A amílase salivar é uma enzima que atua provocando a hidrólise do amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substância de armazenamento. 
A digestão dos alimentos é iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigação, havendo a quebra das grandes partículas alimentares em outras de menores dimensões que vão em seguida ser deglutidas. 
As glândulas submandibulares e sublinguais segregam uma saliva mais grossa que contém a enzima mucina. A outra enzima da saliva é a ptialina, que digere parcialmente os amidos e converte-os em maltose (um tipo de açúcar). A água umedece o alimento, o muco lubrifica-o e a amilase catalisa a hidrólise do amido (polissacarídeo) que o transforma em moléculas de açúcares mais simples (oligossacarídeos e monossacarídeos). A saliva também dissolve algumas moléculas que são captadas pelos receptores de sabor nas papilas gustativas da língua (permitindo o reconhecimento dos sabores). A saliva também dissolve algumas moléculas que são captadas pelos receptores de sabor nas papilas gustativas da língua (permitindo o reconhecimento dos sabores).
Amido é principal produto de reserva nutritiva vegetal, o amido é geralmente encontrado em órgão de reserva nutritiva, como raízes do tipo tuberoso (mandioca, batata doce), caules do tipo tubérculo (batatinha), frutos e sementes, Constitui um polímero de glicose com ligação glicosídica. 
O soluto de lugol é um indicador para testar a presença de amido. O corante irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada (forma helicoidal) do polissacarídeo, produzindo uma cor azul escura. Não reage com monossacarídeo (glicose), nem com dissacarídeo (sacarose).
Material, Métodos e Procedimentos.
Tubos de ensaio; conta gotas; solução de amido 1% (m/v); solução de amilase salivar (saliva doada por um colega do grupo); solução de sacarose 1% (m/v); lugol, banho termostatizado, tubos de ensaio.
São separados 4 tubos de ensaio:
1 ml de amido + 1ml amilase diluída em água;
1 ml de amido + 1 ml de amilase não diluída;
1 ml de sacarose + 1 ml amilase diluída em água;
1 ml de sacarose + 1 ml de amilase não diluída.
Após o preparo os tubos são incubados por 20 minutos, a 37ºC. Depois se adiciona gotas de lugol (Iodo) e então são avaliadas as reações de coloração.
Resultados e Discussão
A solução ficou com a coloração clara (amarelada), mostrando que a enzima dissolveu o amido, restando ela e o lugol.
A solução ficou com a coloração um pouco clara e escura, pois reagiu com menos intensidade do que a com amilase (saliva) diluída (solução anterior), pois está havia muita enzima para pouco substrato;
A solução ficou com a coloração escura (azul escuro ou roxo), não havendo reação, pois a amilase (dissacarídeo) não faz reação com a sacarose;
Coloração escura, não houve reação. (Idem a solução c).
No instante em que a tintura de lugol (iodo) entra em contato com a solução que contém amido, há a formação de um complexo amido-lugol que possui uma cor característica (azul escuro ou roxo). Como a ptialina (saliva) converte as moléculas de amido em moléculas de maltose, o complexo que foi formado anteriormente é desfeito e isso é observado pelo desaparecimento da cor do mesmo, resultando apenas lugol (amarelo) e a ptialina (saliva).
Conclusão
Na prática realizada, o tubo contendo solução de sacarose e amilase salivar primeiramente foi pensado que estes reagiriam, mas a enzima não era especifica para o substrato, não ocorrendo reação, fazendo com que o lugol reagisse com o amido deixando uma sua coloração escura. Portanto, a saliva possui a enzima que acelera a degradação do amido em glicose, restando assim no tubo esta e o lugol (cor amarelada); não havendo reação entre eles (amido e lugol). É valido ressaltar que nesta prática a saliva foi mantida à 37ºC com a finalidade de manter a temperatura corpórea, e em relação ao pH a amilase salivar é neutra; não alterando assim os resultados obtidos na mesma.
Bibliografia
 1. UFSC, Engenharia Bioquímica, 2003, Constituintes dos Microrganismos – Enzimas. [http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/enzimas.htm]
2. Branch A.; Ishii-Iwamoto E. L.; Métodos de Laboratório em Bioquímica; 2003 1ª.
Degradação de corante por Pleurotus sajos-caju
Os processos têxteis são grandes consumidores de água e de corantes sintéticos, geradores de efluentes volumosos e complexos com elevada carga orgânica, aliada ao elevado teor de sais inorgânicos3. A grande diversidade e complexidade desses efluentes, aliadas a imposições da legislação que exigem tratamentos eficientes, têm levado ao desenvolvimento de novas tecnologias que buscam o tratamento melhor e mais adequado, considerando custos, tempo e eficiência dos processos existentes na reciclagem e eliminação de toxicidade4, 5. A preocupação com a estética e qualidade do ambiente atingido por efluentes coloridos leva à busca de alternativas de descoloração, especialmente de corantes têxteis5.
Há diversas formas de tratamento para os efluentes têxteis: físicos, químicos e biológicos, sendo que os microrganismos têm sido intensamente estudados com a finalidade de remover compostos tóxicos do ambiente. As pesquisas de degradação de compostos químicos têm mostrado vários microrganismos extremamente versáteisem degradar substâncias recalcitrantes. Os caminhos atuais da biotecnologia indicam fungos basidiomicetos degradadores de lignina, como eficientes na degradação de grande variedade de compostos e de corantes, com alto potencial de ação na recuperação de ambientes contaminados6. O problema da remoção da cor em efluentes coloridos tem encorajado a busca de tratamentos biológicos para esta finalidade. Os fungos basidiomicetos têm sido apontados como bons degradadores e eficientes na descoloração7, 8. No entanto a utilização destas enzimas para tratamento de efluentes possui custo elevado.
Balan e Monteiro9 empregaram os basidiomicetos Phellinus gilvus, Phanerochaete chrysosporium, Picnoporus sanguineus e Pleurotus ostreatus e constataram a degradação do corante índigo em meio de cultura líquido por estes fungos. Ranzani10 selecionou linhagens de Pleurotus capazes de degradar o corante índigo, utilizando meios de cultura líquido e sólido e constatou que o emprego de bagaço de cana misturado com folha de bananeira como substrato oferece condições favoráveis para a degradação deste corante presente em lodo residual, procedente de estação de tratamento de efluente de uma indústria têxtil.
Pleurotus spp. (Jacq:Fr) Kumm. (Pleurotaceae, Basidiomicetes superiores) é um grupo de cogumelos com alto valor nutricional, possuindo diversas propriedades terapêuticas e aplicações biotecnológicas11, 12. São chamados de fungos causadores da podridão branca da madeira, por eficientemente degradarem a lignina, um polímero fenólico recalcitrante encontrado nos vegetais13. Tal habilidade deve-se ao fato de produzirem diversas enzimas lignocelulolíticas, principalmente lacases, Mn peróxidase e peróxidase versátil, que têm numerosas aplicações industriais12, 13,14.
Entretanto, as investigações científicas na área têxtil ainda são escassas. São necessários esforços em encontrar técnicas de bioestimulação e biorremediação para incrementar os conhecimentos, de forma a modificar a realidade que apresenta o ambiente atingido pelos poluentes.
O objetivo desta experiência foi verificar o potencial de degradação o corante Reactive Blue, por uma linhagem de Pleurotus sajor-caju e se enzimas ligninolíticas estão envolvidas neste processo.
Material, Métodos e Procedimentos.
Placa contendo o Pleurotus sajor-caju, pertencente à coleção de microrganismos do IB-UCS.
Placa contendo o meio de cultivo sólido constituído de: 0,01% do corante Reactive Blue 220, 2% de ágar, 2% de glicose (fonte de carbono), 0,2% extrato de levedura (fonte de nitrogênio), 1% (NH4)2SO4.
Primeiramente é inoculado em formato de um disco de ± 0,5 cm de diâmetro de cultura de Pleurotus sajor-caju no centro da placa contendo o meio de cultivo sólido, após é incubada a placa a 25ºC por cerca de 48 à 72 horas (com supervisão da Profa. Eloane).
Como procedimento de controle e comparação a Profa. Eloane deixou uma placa aberta no laboratório do meio de cultivo sólido contendo o Reactive Blue para compararmos o resultado com as placas incubadas.
Vale ressaltar que o procedimento ocorre próximo da lamparina, para que não haja nenhum contato de outras bactérias.
Resultados e Discussão
Após a incubação, na outra semana, ao olharmos as placas que incubamos, reparamos uma mudança, em que os ± 0,5 cm de diâmetro de cultura de Pleurotus sajor-caju que havíamos colocado na placa cresceram paralelamente e com uma coloração branca. A placa de controle que ficou exposta, a sua coloração ficou amarela com vários outras bactérias e fungos.
Conclusão
O fungo que foi colocado na placa cresceu o que era esperado, pois ao compararmos com a placa que ficou aberta contendo o meio de cultivo sólido reparamos que os fungos e bactérias que nela estavam não conseguiram degradar o corante, pois não tinham as enzimas (lignocelulolíticas) necessárias para isso.
Bibliografia
3. Cegarra, J.; Quim Têxtil 2000, 58, 5.
4. Bumpus, J. A.; Aust, S. D.; Bioassay 1986, 6, 170.
5. Semple, K. T.; Femor, T. R.; Proceedings of the 14th International Congress on the Science and Cultivation of Edible Fungi 1995, 17, 917.
6. Young, L.; Yu, J.; Water Res. 1997, 31, 1187.
7. Barr, D. P.; Aust, S. D.; Environ. Sci. Technol. 1994, 28, 78.
8. Knapp, J. S.; Newby, P. S.; Reece, L. P.; Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 664.
9. Balan, D. S. L; Monteiro, R. T. R.; J. Biotechnol. 2001, 89, 141.
10. Ranzani, M. R. T. C.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 2002.
11. CHANG, S. T.; MILES, P. G. Edible mushrooms and their cultivation. Boca Raton, Fla: CRC Press Inc., 1989.
12. COHEN, R. L.; PERSKY, L.; HADAR, Y. Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 58, n. 5 p. 582-594, 2002.
13. ERIKSSON, K. E. L.; BLANCHETTE, R. A.; ANDER, P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. New York: Springer, Berlin Heidelberg, 1990.
14. STAJIC, M. et al. Effect of different carbon and nitrogen sources on laccase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enz. Microb. Technol., v. 38, n. 1, p. 65-73, 2006.
Prova da catalase
A catalase (teste bioquímico para a diferenciação de Enterobactérias) é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio. 
O gênero Staphylococcus é composto na atualidade de 35 espécies, 17 das quais podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. Eles são imóveis, não formam esporos, são geralmente catalase-positivos. As espécies são anaeróbios facultativos, exceto pelo Staphylococcus saccharolyticus e S. aureus subsp. anaerobius, que são anaeróbios estritos, catalase-negativos e não formam gases a partir de carboidratos. Os estafilococos são geralmente encontrados na pele e em mucosas do homem e de outros animais.
Os seres humanos podem ser colonizados ou infectados por esses microrganismos, devido ao contato frequente ou proximidade de animais (p.ex., veterinários, trabalhadores de zoológicos, fazendeiros). Alguns estafilococos patogênicos para o homem e animais produzem uma enzima denominada coagulase, e a detecção desta enzima é realizada em laboratório para identificação destes microrganismos. As espécies S. aureus (coagulase-positiva), S. epidermidis e S. saprophyticus (coagulase-negativas), são frequentemente encontradas em infecções humanas.
Nesta experiência foi utilizada a bactéria Staphylococcus aureus que é um agente patogênico oportunista humano bem referenciado. Como patógeno nosocomial, S. aureus tem sido uma das causas principais de mortalidade e morbidade. As infecções causadas por S. aureus são normalmente agudas e piogênicas e, se não tratadas, podem se espalhar para o tecido vizinho ou via bacterêmica para áreas metastáticas (envolvendo outros órgãos). Algumas das infecções causadas por S. aureus envolvem a pele; estas incluem furúnculos, celulite, impetigo e infecções em feridas pós-operatórias. Algumas das infecções mais sérias produzidas por este organismo são: bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardites agudas, miocardites, pericardites, cerebrites, meningites, abscessos musculares e cerebrais. 
A presença de S. aureus em alimentos pode representar um potencial perigo à saúde pública porque muitas cepas de S. aureus produzem enterotoxinas. Os sintomas mais comuns de intoxicação alimentar estafilocócica incluem vomito e diarreia, que ocorre de 2 a 4 horas após ingestão do alimento contaminado.
Utilizamos também a bactéria Escherichia coli. Seu habitat primário é o trato gastrintestinal de humanos e outros animais endotérmicos (“de sangue quente”). É considerada um indicador de qualidade de água e alimentos através da análise de coliformes fecais: nome dado a um grupo de bactérias que habita o intestino dos referidos animais. Grande parte da população desse grupo é formada pela Escherichia coli e, dessa forma, sua presença sugere a possibilidade de haver, naquele local, micro-organismos intestinais capazes de provocar doenças. No entanto a presença desta bactéria no intestino não é prejudicial a saúde, mas ao se direcionarpara a circulação sanguínea e assim sendo transportada para outras regiões do corpo, é capaz de provocar infecções. Além disso, ela pode se manifestar também pela ingestão de água ou alimentos contendo cepas da bactéria, liberadas juntamente com as fezes de indivíduos contaminados; pelo contato com animais doentes, e com profissionais da saúde ou instrumentais médicos contaminados. Estas infecções envolvem: Diarreia do viajante, também chamada de gastrenterite, que provoca desarranjos gastrointestinais; Cistite, que provoca inflamação da bexiga urinária; Meningite (inflamação das meninges) em neonatos; Sepse, também chamada de septicemia, que é um quadro grave que une os sintomas de uma infecção generalizada preexistente à resposta inflamatória do organismo; Peritonite, que é a inflamação do peritônio: membrana que reveste parte da cavidade abdominal.
Quanto ao tratamento das infecções por E. coli, geralmente a única medida a ser adotada é a reposição de líquidos. No entanto, tratando-se de outras regiões que não pertencem ao trato digestório, outros procedimentos podem ser requeridos.
Material, Métodos e Procedimentos.
Para este experimento é utilizado a coagulase conjugada (prova em lâmina), conhecida como fator de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos. Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
No teste é avaliada a degradação desse peróxido por essas bactérias, o resultado do teste é confirmado no mesmo momento, no qual, ele será positivo se borbulhar e se não borbulhar é negativo.
Primeiramente é separado duas laminas esterilizada em álcool e a colocadas em uma superfície limpa. Após flamba-se a alça e resfria-se um pouco - para não fritar a colônia de bactérias - retira-se um sedimento da amostra de Staphylococcus aureus e coloca-se na lamina, segue o mesmo procedimento para a amostra de E. coli. Vale ressaltar que o procedimento ocorre próximo da lamparina acessa, para que não haja nenhum contato de outras bactérias.
Então é adicionado gotas de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) e aguarda-se a reação.
Resultados e Discussão
Se a solução borbulhar significa que a catalase é positiva e se ela não borbulhar a catalase é negativa.
Para as duas laminas o resultado foi de catalase-positiva.
Conclusão
As bactérias E. coli e Staphylococcus aureus houve produção de catalase.
Sendo tóxico para as células, o peróxido de hidrogénio (produto decorrente do metabolismo celular em organismos expostos ao oxigénio atmosférico) tem de ser rapidamente convertido numa espécie química que seja inócua. A catalase pode catalisar a decomposição de até 40.000.000 moléculas de peróxido de hidrogénio por segundo12, tornando-a numa enzima importante para a desintoxicação desta substância.
Algumas células do sistema imunológico produzem peróxido de hidrogénio para uso como agente antibacteriano. As bactérias patogénicas que possuem catalase são capazes de resistir a este ataque graças à presença da enzima, conseguindo sobreviver nas células que invadem.
Bibliografia
11. Periódico Informativo CEFAR de Microbiologia, Ano II, Ed. Set/Out/2005.
12. NELSON, David L., COX, Michael M., Lehninger Principles of Biochemistry, 4ª edição.