Extração de DNA

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P R O F A . R E N A T A S I N D E A U X 
Aula 04: 
Extração/Isolamento de DNA 
Introdução 
—  A extração de DNA é o isolamento e purificação desse ácido 
nucleico de células nucleadas de amostras biológicas, tais 
como: 
¡  Sangue total (EDTA/ACD); 
¡  Camada leucocitária (Buffy Coat); 
¡  Medula óssea; 
¡  Mucosa bucal; 
¡  Células em cultura; 
¡  Bulbo capilar; 
¡  Polpa dentária; 
¡  Tecidos frescos, congelados ou parafinados; 
¡  Fluidos corpóreos: sêmen, urina, lavado 
 broncoalveolar,etc; 
 
 
 
 
Amostras de sangue 
—  O sangue é o padrão-ouro de material 
utilizado para extração de DNA porque é 
fonte abundante de informação genética 
e por fornecer amostra fresca para 
análise; 
—  Uma célula diplóide contém 
aproximadamente 6 pg de DNA x 3 pg de 
DNA para espermatozóide; 
—  Em média , 1 adulto tem de 5- 10 x 106 
leucócitos/ml de sangue. Assim, cada µl 
de sangue tem de 30 a 60 ng de DNA. 
Cuidados com amostras de sangue 
—  Coleta: com anticoagulantes EDTA (preferido) ou ACD. 
Heparina= Inibe enzimas importantes nos métodos 
moleculares (inadequado). 
—  Armazenamento: 
 - 22–25°C: não recomendado (<24 hours); 
 - 2–8°C : por algumas semanas; 
 - -20°C : apenas o buffy coat (após lise de eritrócitos) por 
menos de 7 anos; 
 - -70°C : apenas o buffy coat (após lise de eritrócitos) por 
mais de 7 anos; 
 
OBS: Nunca em nitrogênio líquido (temperaturas baixas 
demais fazem o DNA adsorver moléculas de N2 na sua superfície, impossibilitando o seu uso). 
A extração de DNA consiste em três etapas 
fundamentais: 
1- Lise ou ruptura (física e/ou química) das membranas 
celulares para liberação do material genético: 
÷ Aquecimento, Digestão Enzimática, Detergente, Solução 
salina... 
÷ Quantidade do DNA – Tempo e concentração 
 
2- Purificação - separação do DNA dos demais 
componentes celulares: 
÷ Coluna, Solvente Orgânico, NaCl; 
÷ Qualidade do DNA 
 
3- Precipitação DNA: 
÷ Etanol 
÷ Acetona 
 
Método de Salting out 
TKM1(Tris-HCl, KCl 
 MgCl2, EDTA) 
IGEPAL (detergente 
 não – iônico) 
 
TKM2 
(Tris-HCl, KCl 
 MgCl2, EDTA 
NaCl) 
SDS (detergente 
aniônico) 
 
 
Buffy coat 
ou sangue 
total 
Etanol 
100% 
1. Incubar 
55°C/ 24h; 
2. NaCl 6M 
3. Vortex 
4. Centrifugar 
Eluir em TE 
(Tris-EDTA) 
—  SEGUIR PROTOCOLO!!! 
—  TKM 1: 
 
Reagentes [ ] Estoque Volume 
Tris-HCl pH 7,6 1M 5 mL 
KCl 1M 5 mL 
MgCl2 1M 5 mL 
EDTA (0,1M) 10 mL 
H2O purificada q.s.p 500 mL 
 
 
EDTA - quelante de cátions 
divalentes como Mg2+, um 
cofator importante para ação de 
nucleases de DNA (DNAses) 
Método de Salting out 
—  Igepal® (Nonidet): Detergente não iônico que 
solubiliza as proteínas de membrana das hemácias. 
 
TKM1 + Igepal 
Lise de membrana externa celular das 
hemácias, porém sem ruptura da 
membrana dos leucócitos 
Agitação mecânica em 
vórtex 
—  Após agitar e centrifugar… 
 
Pellet de leucócitos 
—  TKM 2: 
 
 
 
Reagentes [ ] Estoque Volume 
Tris-HCl pH 7,6 1M 0,5 mL 
KCl 1M 0,5 mL 
MgCl2 1M 0,5 mL 
EDTA (0,1M) 1,0 mL 
NaCl 1M 20 mL 
H2O purificada q.s.p 50 mL 
—  SDS: 
 
 -Dodecil Sulfato de Sódio; 
 -Detergente aniônico que solubiliza lipídeos; 
 
 -Desnaturante de proteínas e também rompe ligações não-covalentes 
inter-subunidades de proteínas oligoméricas. 
 
 
 
 
 TKM2 + SDS = Lise de membrana 
plasmática e nuclear dos leucócitos 
—  NaCl saturado (6M): 
-Auxilia na dissociação das proteínas ligadas aos ácidos nucléicos 
(histonas). Íons no meio aquoso podem romper ligações iônicas de 
cadeias polipeptídicas.; 
 
-O NaCl neutraliza a carga negativa do DNA, permitindo que as várias 
moléculas de DNA presentes na solução possam se agregar e assim 
formar um precipitado visível em etanol. 
 
 
- 
 
 
 
—  Etanol: 
-Etanol absoluto: utilizado para precipitar ácidos nucléicos 
com mais de 15 nucleotídeos. Sais e outros solutos ficam em 
solução enquanto que ácidos nucléicos formam um precipitado 
branco que pode ser coletado por centrifugação; 
 
- Etanol 70%: o DNA é insolúvel em Álcool e os 30% de H2O, 
possibilitam a solubilização do restante dos sais presentes no 
tubo. 
 
 
- 
 
 
 
—  O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as 
proteínas, de 280 nm; 
—  Para estimar a concentração de DNA, utiliza-se a relação: 
1 DO260 = 50 ug/ml de DNA de dupla hélice; 
—  A relação entre a quantidade de DNA e de proteína DO260/
DO280à parâmetro para avaliação da qualidade do DNA 
extraído; 
—  Amostras cujos valores dessa relação são inferiores a 1,8 
apresentam contaminação com proteínas. 
 
 
 
Concentração e pureza do DNA obtido 
J O H N , S . W. M . E T A L . A R A P I D P R O C E D U R E F O R 
E X T R A C T I N G G E N O M I C D N A F R O M 
L E U K O C Y T E S . N U C L E I C A C I D S R E S E A R C H . ( 1 9 ) :
2 , 4 0 8 . 1 9 9 0 
 
Referência: