Prática PCR e aplicações

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S 
REAÇÃO EM CADEIA 
DA POLIMERASE - PCR 
Profa: Renata Sindeaux 
 
Componentes para PCR 
S  Enzima à Uma DNA polimerase termoestável; 
S  Quatro dNTPs à A, T, C, G “blocos de construção” do 
DNA; 
S  Molde ou template à contendo a seqüência alvo da PCR; 
S  Primers sintéticos (forward e reverse) à proporcionam os 
sítios de iniciação para copiar a seqüência alvo; 
S  Tampão à proporcionam o pH ideal para a atividade da 
enzima e da especificidade hibridização ao DNA; 
S  Cátion metal divalente à Mg+2. 
Etapas 
Etapas 
Amplificação exponencial 
Preparo do Mix de PCR 
Reagente Concentração final Volume final (μL) 
Água q.s.p 17,95 
Buffer 1X 2,50 
MgCl2 1,5 mM 0,75 
Primer F 0,3 μM 0.75 
Prime R 0,3 μM 0,75 
dNTP 0,2 mM 0,50 
Taq 1U 0,30 
Amostra (DNA) ----- 1,50 
Volume final 25 
Preparo do Mix de PCR 
Aplicação do PCR 
S  A alta sensibilidade do método de PCR, 
bem como a sua especificidade, nos 
permite amplificar uma sequência-alvo a 
partir de amostras com quantidades 
mínimas de DNA, o que torna o método 
viável não só para a pesquisa básica mas 
também para a pesquisa aplicada. 
Aplicação do PCR 
S  Detecção de deleções/inserções determinadas pela geração de 
produtos amplificados que apresentam alterações em seu 
tamanho; 
S  Detecção de mutações pontuais (substituição de bases), 
conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser 
determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do 
sequenciamento. 
Aplicação do PCR 
S  No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem 
genética, como o câncer, através do estudo dos genes 
relacionados a essas doenças; 
S  Investigação forense; 
S  Testes de paternidades; 
S  No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes 
patogênicos diversos. 
S  Engenharia Genética 
Literatura 
S  Biologia Molecular da Célula – Alberts et al; 
S  Princípios de Bioquímica – Lehninger; 
S  Link: http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g 
S  Link: http://www.youtube.com/watch?v=70N_l4Py2pk