Eletroforese: Técnica de Separação de Macromoléculas

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ELETROFORESE	
  
Renata	
  Helena	
  M.	
  Sindeaux	
  
Introdução	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  A	
  eletroforese	
  é	
  uma	
  técnica	
  usada	
  para	
  
separar,	
  e	
  algumas	
  vezes,	
  purificar	
  
macromoléculas	
  –	
  especialmente	
  proteínas	
  e	
  
ácidos	
  nucléicos	
  –	
  que	
  se	
  diferem	
  em	
  tamanho,	
  
carga	
  e	
  conformação.	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  É	
  uma	
  das	
  técnicas	
  mais	
  usadas	
  em	
  
laboratórios	
  de	
  bioquímica	
  e	
  de	
  biologia	
  
molecular.	
  	
  
Variedade	
  de	
  uso	
  
—  Verificação	
  de	
  produtos	
  de	
  PCR	
  
—  Comparativo	
  de	
  paternidade	
  
—  Rastros	
  de	
  amostras	
  biológicas	
  em	
  cenas	
  de	
  crimes	
  
—  Procura	
  de	
  mutações	
  
—  Análise	
  de	
  proteínas	
  plasmáticas	
  
—  Análise	
  de	
  expressão	
  protéica	
  (Western	
  Blotting)	
  
Princípio	
  da	
  técnica-­‐	
  	
  
Diferença	
  de	
  potencial	
  elétrico	
  
—  Separação	
  de	
  fragmentos	
  protéicos	
  ou	
  de	
  ácidos	
  
nucléicos	
  sobre	
  uma	
  matriz	
  de	
  gel;	
  
—  Moléculas	
  carregadas	
  são	
  colocadas	
  sob	
  uma	
  
campo	
  elétrico	
  migram	
  para	
  pólo	
  positivo	
  
(ânodo)	
  ou	
  negativo	
  (cátodo),	
  de	
  acordo	
  com	
  a	
  
sua	
  carga;	
  
—  DNA	
  tem	
  carga	
  negativa	
  (grupos	
  fosfato)	
  e	
  
migrará	
  para	
  o	
  polo	
  positivo;	
  
—  Proteínas	
  podem	
  ter	
  carga	
  total	
  positiva	
  ou	
  
negativa.	
  
	
  
	
  
— Velocidade	
  de	
  migração	
  depende:	
  	
  
-­‐  Tamanho	
  do	
  fragmento;	
  
-­‐  	
  Conformação	
  da	
  molécula;	
  
-­‐  	
  Carga	
  total	
  da	
  molécula;	
  
-­‐  	
  Corrente	
  elétrica	
  aplicada	
  (intensidade	
  da	
  diferença	
  
de	
  potencial	
  elétrico)	
  
	
  
Princípio	
  da	
  técnica-­‐	
  	
  
Velocidade	
  de	
  migração	
  das	
  cargas	
  
ÂNODO CÁTODO 
Matrizes	
  para	
  eletroforese	
  
— GEL	
  DE	
  AGAROSE:	
  	
  
	
  -­‐	
  Polissacarídeo	
  extraído	
  de	
  algas	
  marinhas;	
  
	
  	
  	
  -­‐	
  Normalmente	
  é	
  usada	
  em	
  concentrações	
  entre	
  
0,5	
  a	
  2,0%;	
  	
  
	
  -­‐	
  Faixa	
  de	
  separação	
  ampla,	
  porém	
  com	
  baixo	
  
poder	
  de	
  resolução;	
  
	
  	
  	
  -­‐	
  Fragmentos	
  de	
  DNA	
  de	
  200	
  pb	
  a	
  50000	
  pb	
  
1	
  Kb	
  
Matrizes	
  para	
  eletroforese	
  
— GEL	
  DE	
  POLIACRILAMIDA:	
  
	
   	
  -­‐	
  Polímero	
  ramificado	
  de	
  acrilamida;	
  
	
  -­‐	
  Normalmente	
  utilizada	
  nas	
  concentrações	
  
entre	
  3,5	
  a	
  20%.	
  
	
  -­‐	
  Mais	
  trabalhoso	
  para	
  preparar	
  do	
  que	
  a	
  
agarose;	
  
	
  -­‐	
  Faixa	
  pequena	
  de	
  separação,	
  porém	
  com	
  
alto	
  poder	
  de	
  resolução	
  (fragmentos	
  com	
  
diferença	
  de	
  até	
  um	
  pb);	
  
	
  -­‐	
  Bastante	
  usados	
  na	
  separação	
  e	
  
caracterização	
  de	
  proteínas;	
  
	
  	
  -­‐	
  Neurotóxica	
  
	
  
Materiais	
  e	
  aplicação	
  das	
  
amostras	
  
Materiais	
  e	
  aplicação	
  das	
  
amostras	
  
Corrida	
  da	
  amostra	
  no	
  gel	
  
—  Corante	
  de	
  corrida:	
  para	
  monitorar	
  a	
  corrida;	
  
—  Voltagem:	
  quanto	
  maior	
  a	
  voltagem	
  mais	
  rápida	
  será	
  
a	
  migração;	
  
—  Tampão	
  de	
  eletroforese:	
  mantêm	
  o	
  pH	
  e	
  fornecem	
  os	
  
íons	
  para	
  permitir	
  a	
  condutividade	
  na	
  cuba	
  de	
  
eletroforese.	
  Os	
  mais	
  usa:	
  TBE	
  (Tris-­‐	
  Borato-­‐	
  EDTA)	
  e	
  
TAE	
  (Tris-­‐Acetato-­‐EDTA).	
  
Revelação	
  das	
  amostras-­‐	
  
Brometo	
  de	
  E;dio	
  (EtBr)	
  
—  É	
  um	
  corante	
  fluorescente,	
  cujas	
  moléculas	
  que	
  se	
  
intercalam	
  entre	
  as	
  bases	
  de	
  DNA	
  permitindo	
  a	
  
visualização	
  sob	
  luz	
  ultravioleta	
  (590nm);	
  
—  É	
  um	
  sal	
  (não	
  volátil),	
  mutagênico	
  e	
  cancerígeno	
  de	
  ação	
  
tópica	
  (contato).	
  
Transiluminador	
  
	
  
SYBR	
  Green®	
  >	
  Molecular	
  Probes	
  1995	
  	
  
—  Revolucionou	
  a	
  detecção	
  de	
  DNA	
  
em	
  géis	
  
—  A	
  intensidade	
  da	
  fluorescência	
  
do	
  SYBR	
  Green	
  é	
  aumentada	
  em	
  
100x	
  quando	
  se	
  liga	
  ao	
  DNA.	
  
—  	
  Consegue-­‐se	
  ver	
  picogramas	
  de	
  
DNA.	
  
—  Junto	
  a	
  sua	
  sensibilidade	
  superior	
  
o	
  SYBR	
  Green	
  tem	
  outras	
  
vantagens	
  sobre	
  o	
  EtBr:	
  É	
  muito	
  
menos	
  mutagênico	
  e	
  pode	
  ser	
  
adicionado	
  diretamente	
  àamostra	
  
antes	
  da	
  eletroforese.	
  	
  
6b	
  
9	
  4	
   14	
   22	
  16	
   23	
   C1	
   C5	
  
7b	
  
9	
  4	
   14	
   22	
  16	
   23	
   C1	
   C5	
  
9b	
  
9	
  4	
   14	
   22	
  16	
   23	
   C1	
   C5	
  
2652	
  bp	
  
800	
  bp	
  
350	
  bp	
  
Eletroforese	
  de	
  proteínas	
  plasmáLcas	
  
γ	
β	
α2	
Albumina 
α1	
: Orosomucoide, α1 Antitripsina 
: Haptoglobina, α2 Macroglobulina, α Lipoprotéina, 	
 Ceruloplasmina 
: Transferrina, Hemopexina, Complemento C3, 
 β Lipoproteína 
: Imunoglobulinas 
Eletroforese	
  de	
  proteínas	
  plasmáLcas	
  
Eletroforese de proteínas 
séricas em gel de agarose, 
(1) hipergamaglobulinemia 
em processo inflamatório; 
(2) e (3): fracionamento 
normal; (4) gama 
monoclonal no mieloma 
múltiplo.