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Expressão gênica - Parte II: Microarray: transcriptômica e proteômica na análise de expressão Profa. Renata Sindeaux Era Pré- Genômica Era Pós- Genômica Transcriptômica A transcriptômica estuda a atividade dos genes em determinado tempo ou local ou condição ambiental => expressão gênica global. Técnicas que permitem a análise do transcriptoma: o conteúdo de mRNA de uma célula (reflete o padrão de expressão gênica). Tecnologia de Microarray (Microarranjos) • Análise em alta escala • Visão global de processos ou amostras de tecidos. • Tecnologia para exploração biológica que permite a medição simultânea dos níveis de expressão de até 100.000 genes. • Medida da quantidade de mRNA para cada gene em uma dada amostra. Princípio • O microarray funciona explorando a capacidade de um mRNA de se ligar (hibridar) ao seu DNA molde (sonda). • Usando um arranjo contendo muitas amostras de DNA, representando cada uma um único gene, é possível determinar em um único experimento o nível de expressão de milhares de genes de uma célula/tecido. • Mede-se quanto mRNA se ligou (hibridou) em cada spot ou amostra de DNA do arranjo. • Microarrays são em geral lâminas de vidro com uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas; • Um spot contém milhões de moléculas de cDNA idênticas (sondas). • O microarray pode conter milhares de spots – Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano. Matriz onde estão fixados milhares de segmentos de oligonucleotídeos correspondentes aos genes. Spot contendo várias cópias de cDNA (sondas) de um gene específico • Milhares de spots representando genes Intensidade de cada spot: • Quantidade de cDNA hibridizado • Quantidade de mRNA transcrito na amostra Tipos de microarrays “GENÔMICOS”: • Comparative genomic hibridization (CGH): verificar perdas ou ganhos gênicos ou verificar aumento no número de cópias de um gene. • Análise de mutação: Uso de arrays com DNA contendo SNPs, por exemplo. A amostra de DNA vai hibridizar com mais frequência aos SNPs específicos da amostra. “TRANSCRIPTÔMICOS” : • análise de expressão gênica diferencial. Aplicações • identificação de genes envolvidos em numerosos processos biológicos; ex.: identificação de genes expressos durante diferentes etapas do desenvolvimento Classificação e prognóstico de doenças • Padrões de expressão de um determinado tecido. • Descoberta de padrões de expressão para determinadas doenças Resposta a tratamento de doenças • Análise de expressão gênica sem e com tratamento, antes e após tratamento – verificação da eficiência da droga • Identificar alvos moleculares apropriados para intervenção terapêutica Expressão diferencial de determinados genes identificam grupos de maior risco – terapias adjuvantes devem ser aplicadas • Câncer: identificação e comparação de genes expressos diferencialmente em tecidos normais e malignos - diagnóstico, avaliação, prognóstico (o perfil de expressão permite estimar bom e mau prognóstico); - definição da terapêutica e desenho de novas drogas para tratamento das diferentes neoplasias humanas; - descrever possíveis mecanismos na tumorigênese envolvendo os genes identificados Limitação • http://biointelligence.wordpress.com/microar ray_research/ • http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/ microarray/ ANÁLISE DA EXPRESSÃO PROTEICA 23 WESTERN BLOTTING 25 PROTEÔMICA • Identificação, caracterização e quantificação de todas as proteínas envolvidas em uma: • cadeia particular, • organela, • célula, • tecido, • órgão ou • organismo Alguns objetivos da análise de Proteomas • Separar, identificar e catalogar todas as proteínas existente na amostra biológica analisada. • Identificar diferenças protéicas específicas que diferem duas ou mais condições que estão sendo comparadas. • Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos 30 OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA Proteômica Nível de expressão de proteínas Modificações Pós-traducionais Interações entre proteínas Identificação de Biomarcadores Análise Proteômica é dirigida por dois processos: separação de proteínas e análise espectral de massa. Análise espectral de massa (Espectrometria de massa) Determinação de massa de proteína intacta Determinação de massa de peptídeos obtidos por proteólise Determinação estrutural Sequência de aminoácidos Método de separação de proteínas 32 • Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: 1- ponto isoelétrico (pI) e 2- massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico: – 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica • pI – 2ª Etapa: Eletroforese em gel de poliacrilamida + SDS (SDS- PAGE) • Tamanho (massa molecular) ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 33 (menor) M.M. SDS-PAGE (maior) 4. Detecção das proteínas nos géis • Coomassie • Prata • Fluorescência 36 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (-) M.M. pI (+) (-) SDS : confere carga negativa às proteínas Proteoma Comparativo ou Diferencial condição condição Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA Digestão: tripsina Espectrômetro de massas m/z Espectros de massas Programas: identificar a proteína Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação através de um campo elétrico ou magnético. ESPECTROMETRIA DE MASSAS CONCLUSÕES: • Combinada com a identificação por EM, é a principal técnica utilizada em estudos proteômicos • Pode separar alguns milhares de proteínas simultaneamente dependendo do tamanho do gel, da concentração de acrilamida e da faixa de pH. • Produz um mapa de proteínas que reflete alterações nos níveis de expressão, presença de isoformas e de modificações pós-traducionais 42 Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) José Maurício Maciel Cavalcante PPGCV-UECE • É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é utilizado até três diferentes amostras de proteínas marcadas com corantes fluorescentes (Ex.: Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D. • Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado com o comprimento de onda de excitação de cada corante um após o outro. • É utilizado para observação de mudanças no perfil protéico entre amostras • Ex: Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e doentes. 44 45 ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE) controle Teste Cy5 Cy5 UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008) Digitalização das imagens 5. Digitalização das amostras 48 Omics e Medicina OMICS é um termo geral para a ciência de analisar as interações entre as informações biológicas obtidas da genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica. • Genômica • Transcriptômica • Proteômica • Metabolômica • Farmacogenômica • Transplantômica MEDICINA P3 = PREDITIVA, PERSONALIZADA, PREVENTIVA
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