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Análise de expressão Microarray transcriptoma proteoma

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Expressão gênica - Parte II: 
Microarray: transcriptômica e 
proteômica na análise de 
expressão 
Profa. Renata Sindeaux 
Era 
Pré-
Genômica 
Era 
Pós-
Genômica 
Transcriptômica 
A transcriptômica estuda a atividade dos genes 
em determinado tempo ou local ou condição 
ambiental => expressão gênica global. 
Técnicas que permitem a análise do 
transcriptoma: o conteúdo de mRNA de uma 
célula (reflete o padrão de expressão gênica). 
Tecnologia de Microarray (Microarranjos) 
 
• Análise em alta escala 
• Visão global de processos ou amostras de 
tecidos. 
• Tecnologia para exploração biológica que 
permite a medição simultânea dos níveis de 
expressão de até 100.000 genes. 
• Medida da quantidade de mRNA para cada 
gene em uma dada amostra. 
 
Princípio 
• O microarray funciona explorando a capacidade de 
um mRNA de se ligar (hibridar) ao seu DNA molde 
(sonda). 
 
• Usando um arranjo contendo muitas amostras de 
DNA, representando cada uma um único gene, é 
possível determinar em um único experimento o 
nível de expressão de milhares de genes de uma 
célula/tecido. 
 
• Mede-se quanto mRNA se ligou (hibridou) em cada 
spot ou amostra de DNA do arranjo. 
 
• Microarrays são em geral lâminas de vidro com 
uma matriz de pontos (spots) impressa sobre 
elas; 
 
• Um spot contém milhões de moléculas de cDNA 
idênticas (sondas). 
 
• O microarray pode conter milhares de spots 
– Por exemplo, um spot para cada gene do 
genoma humano. 
Matriz onde estão fixados milhares de segmentos de 
oligonucleotídeos correspondentes aos genes. 
Spot contendo várias 
cópias de cDNA (sondas) de 
um gene específico 
• Milhares de spots representando genes 
 
Intensidade de cada spot: 
• Quantidade de cDNA hibridizado 
• Quantidade de mRNA transcrito na amostra 
Tipos de microarrays 
 
“GENÔMICOS”: 
• Comparative genomic hibridization (CGH): verificar perdas ou 
ganhos gênicos ou verificar aumento no número de cópias de 
um gene. 
• Análise de mutação: Uso de arrays com DNA contendo SNPs, 
por exemplo. A amostra de DNA vai hibridizar com mais 
frequência aos SNPs específicos da amostra. 
 
“TRANSCRIPTÔMICOS” : 
• análise de expressão gênica diferencial. 
 
Aplicações 
 
 
• identificação de genes envolvidos em numerosos 
processos biológicos; ex.: identificação de genes 
expressos durante diferentes etapas do 
desenvolvimento 
 
Classificação e prognóstico de doenças 
• Padrões de expressão de um determinado tecido. 
• Descoberta de padrões de expressão para determinadas 
doenças 
 
Resposta a tratamento de doenças 
• Análise de expressão gênica sem e com tratamento, antes e 
após tratamento – verificação da eficiência da droga 
• Identificar alvos moleculares apropriados para intervenção 
terapêutica 
 
Expressão diferencial de determinados genes identificam grupos 
de maior risco – terapias adjuvantes devem ser aplicadas 
• Câncer: identificação e comparação de genes expressos 
diferencialmente em tecidos normais e malignos 
 
- diagnóstico, avaliação, prognóstico (o perfil de expressão 
permite estimar bom e mau prognóstico); 
 
- definição da terapêutica e desenho de novas drogas para 
tratamento das diferentes neoplasias humanas; 
 
- descrever possíveis mecanismos na tumorigênese 
envolvendo os genes identificados 
 
Limitação 
 
• http://biointelligence.wordpress.com/microar
ray_research/ 
• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/
microarray/ 
ANÁLISE DA EXPRESSÃO PROTEICA 
 
 
23 
WESTERN BLOTTING 
25 
PROTEÔMICA 
 
• Identificação, caracterização e quantificação de 
todas as proteínas envolvidas em uma: 
• cadeia particular, 
• organela, 
• célula, 
• tecido, 
• órgão ou 
• organismo 
 
 
Alguns objetivos da análise de Proteomas 
• Separar, identificar e catalogar todas as proteínas 
existente na amostra biológica analisada. 
 
• Identificar diferenças protéicas específicas que 
diferem duas ou mais condições que estão sendo 
comparadas. 
 
• Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos 
30 
OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA 
Proteômica 
Nível de expressão de proteínas 
Modificações Pós-traducionais 
Interações entre proteínas 
Identificação de Biomarcadores 
Análise Proteômica é dirigida por dois processos: 
 separação de proteínas e análise espectral de massa. 
Análise espectral de massa (Espectrometria de massa) 
Determinação de 
massa de proteína 
intacta 
Determinação de 
massa de 
peptídeos obtidos 
por proteólise 
Determinação 
estrutural 
Sequência de 
aminoácidos 
Método de separação de proteínas 
32 
• Separação de misturas proteícas com base em dois 
parâmetros físico-químicos: 
1- ponto isoelétrico (pI) e 
2- massa molecular (M.M.), 
sob a influência de um campo elétrico: 
 
– 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica 
• pI 
 
– 2ª Etapa: Eletroforese em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-
PAGE) 
• Tamanho (massa molecular) 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
33 
(menor) 
M.M. 
SDS-PAGE 
(maior) 
4. Detecção das proteínas nos géis 
• Coomassie 
• Prata 
• Fluorescência 
36 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
(+) 
(-) 
M.M. 
pI (+) (-) 
SDS : confere carga negativa às proteínas 
Proteoma Comparativo ou Diferencial 
condição condição 
Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA 
Digestão: tripsina 
Espectrômetro de massas 
m/z 
Espectros de massas 
Programas: identificar a 
proteína 
 Técnica analítica que identifica a composição química 
de compostos, pela determinação de suas massas 
moleculares na forma iônica, baseada na sua 
movimentação através de um campo elétrico ou 
magnético. 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS 
CONCLUSÕES: 
• Combinada com a identificação por EM, é a principal técnica 
utilizada em estudos proteômicos 
 
• Pode separar alguns milhares de proteínas simultaneamente 
dependendo do tamanho do gel, da concentração de 
acrilamida e da faixa de pH. 
 
• Produz um mapa de proteínas que reflete alterações nos 
níveis de expressão, presença de isoformas e de modificações 
pós-traducionais 
 
42 
Eletroforese em gel diferencial 
(Difference gel electrophoresis -DIGE) 
José Maurício Maciel Cavalcante 
PPGCV-UECE 
• É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é utilizado até 
três diferentes amostras de proteínas marcadas com corantes 
fluorescentes (Ex.: Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D. 
 
• Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado com o 
comprimento de onda de excitação de cada corante um após 
o outro. 
 
• É utilizado para observação de mudanças no perfil protéico 
entre amostras 
 
• Ex: Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e doentes. 
 
44 
45 
ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D 
(DIGE) 
controle 
Teste 
Cy5 
Cy5 
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008) 
Digitalização das imagens 
5. Digitalização das amostras 
48 
Omics e Medicina 
 
OMICS é um termo geral para a ciência de analisar as 
interações entre as informações biológicas obtidas da 
genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica. 
 
• Genômica 
• Transcriptômica 
• Proteômica 
• Metabolômica 
• Farmacogenômica 
• Transplantômica 
MEDICINA P3 = 
PREDITIVA, PERSONALIZADA, 
PREVENTIVA

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