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Doença de Newcastle Luciano Doretto Júnior + Antônio Carlos Paulillo Doença de Newcasde (DN), também conhecida como pseudopeste aviária, pneumoencefalite aviária, distúrbio respiratório-nervoso e em nível internacional- Newcastle disease, faz parte da lista A * do código zoossanirário internacional da Organização Mundial de Saúde Animal (OlE), e a notificação dos focos da doença é compulsória. A definição mais recente da DN é uma infecção de ave causada por um vírus do sorotipo Paramyxovirus aviátio tipo 1 (APMV-1), que apresente índice de patogenicidade intracerebral (lPIC) em pintos, Gallus gallus, SPF (specific pathogen ftee) de 1 dia de idade maior que 0,7; ou demonstre, por meio de seqüenciamento, os aminoácidos básicos do genoma viral na posição terminal "C" da proteína F2 e fenilalanina na posição 117 da posição terminal "N" da proteína FI. Os termos múltiplos aminoácidos básicos referem-se aos três últimos tesíduos de arginina ou lisina entre as posições 113 e 116 do genoma viral. ETIOLOGIA Os vírus membros da família Paramyxoviridae são vírus RNA envelopados, de fita simples, que possuem genoma não segmentado de polaridade negativa. Durante o processo de replicação, o vírus apresenta o capsídeo projetado no citoplasma e o envelope aderido à superfície da célula infectada. Por meio de microscopia eletrônica de transmissão, as partículas aparecem pleomórficas, variando entre 100 e 500nm de diâmetro, de formato aproximadamente esférico, e transvetsalmente o filamento mede 100nm. A família Paramyxoviridae é subdividida em duas subfamílias: Pneumovitinae, composta de um único gênero, o Pneumovirus, englobando os pneumovirus aviários, e a subfamília Paramyxovirinae, que é composta por três gêneros: Morbillivirus. Cujo protótipo é o vírus da rubéola, englobando o vírus da cinomose canina. * Doença transmissível que apresenta alta patogenicidade e rápida difusão, além dos limites de um país ou região, com sérias conseqüências soei 0econômicas e/ou de saÚde pÚblica e é de grande importância para o comércio internacional de animais e seus subprodutos. Paramyxovirus. Onde o modelo desse gênero é o vírus da paralnfluenza humana tipo 1; e o gênero inclui ainda vírus da paralnfluenza bovina e humana tipo 3. Rubulavirus. O protótipo desse gênero é o vírus da caxumba humana. O vírus da doença de Newcasde (VDN) e os outros paramixovírus aviários foram recentemente colocados nesse gênero. Os membros do gênero Rubulavirus, que infectam as espécies de aves, apresentam nucleocapsídeo, em forma de espiral, com aproximadamente 18nm de diâmetro e 5nm de espessura. As partículas virais apresentam projeções típicas cobrindo toda a superfície que está inserida dentro do envelope. Essas projeções, ou espículas, são encontradas em dois tamanhos; uma maior, de aproximadamente 8nm de comprimento, que consiste em uma simples glicoproteína (HN), em que estão associadas as atividades de hemaglutinação e neuraminidase. As espículas menores são formadas pela glicoproteína F, que está associada à habilidade do envelope viral em fundir-se às membranas celulares do hospedeiro, seguindo a introdução do material genético viral na célula, e em causar a fusão das células infectadas, resultando no característico efeito citopáticoformação de sincício. Os dados dos testes de inibição da hemaglutinação (HI), imunodifusão dupla em gel de ágar, soroneutralização (SN), inibição da neuraminidase e outros testes sorológicos, bem como propriedades da estrutura viral, têm sido utilizados para diferenciar os nove grupos de paramixovírus aviários. Os sorotipos têm sido descritos como APMV-1 até APMV-9. O mesmo esquema de nomenclatura, utilizado para os virus da influenza tipo A, foi adotado para denominar os paramixovírus de aves. Deve-se descrever sempre: (1) sorotipo, (2) espécie ou tipo de ave em que o vírion foi isolado, (3) localização geográfica do isolamento, (4) número ou nome de referência e (5) ano de isolamento (por exemplo, APMV31 parakeet/Netherlandsl 449/75). A Tabela 18.1 descreve o protótipo de cada um dos sorotipos, bem como o hospedeiro usual e os sintomas observados nas aves afetadas. A exceção do APMV-6, que ocasionalmente foi isolado de perus. Dados patológicos em galináceos foram descritos apenas com vírus dos sorotipos APMV-1, APMV-2 e APMV-3. RESISTÊNCIA DO VíRUS o VDN possui um envelope formado de membrana celular modificada, a partir do brotamento vital da célula do hospedeiro no momento da multiplicação. Esta é uma importante característica do paramixovírus aviário, porque esse envelope produz então um meio ambiente instável, em que a ação de luz solar, luz ultravioleta do aquecimento, da oxidação, pH e a maioria dos agentes químicos destroem o vírus. O APMV-l é inativado à temperatura ambiente com os seguintes compostos químicos: álcool etílico a 70%, fenol a 3%, tintura de iodo a 1 %, lisol a 1 %, soda caústica a 2%, acetona a 50% e permanganato de potássio diluído 1 :5.000. Temperaturas elevadas e a tadiação solar facilitam a inativação do vírion pelos agentes químicos, enquanto baixas temperaturas interrompem a sua inativação. Algumas estitpes são inativadas a 56°C em 5min, porém outras levam até 6h para serem destruídas. São inativados em lmin a 100°e, O cozimento a 80°C destrói o vírion em produtos cárneos. Em penugem de pintos conser- :c vados a 3rc, o vírus permanece viável por até 87 dias e, na ~ superfície de ovos, por até 126 dias. Em aviários, o VDN permai nece ativo por até 235 dias e, quando exposto à radiação solar ~ diteta, o vírus morre rapidamente. Em órgãos de aves infectadas o;à e conservadas a 37°C, o vírion permanece ativo por até 125 dias. O VDN, quando exposto à luz ultravioleta com raios de 1.600 a 1.800nm, é inativado entre 0,8 e 1,08 segundo. O VDN pode suportar extremos de pH, entre 2 e 10, por algumas horas. A papaína inativa o VDN no pH 7, mas o título hemaglutinante é pouco afetado. EPIDEMIOLOGIA Estirpes do VDN têm sido agrupadas, para fins didáticos, em cinco pato tipos, com base nos sinais clínicos observados nas aves infectadas. Esses patotipos são: Velogênico viscerotrópico. Apresenta-se altamente patogênico, culminando em altoS índices de mortalidade. Freqüentemente são observadas lesões hemorrágicas intestinais e respIratórias. Velogênico neurotrópico. É o que apresenta alta mortalidade e, usualmente, são observados sinais nervosos e respiratórios. Mesogênico. Apresenta sinais respiratórios mais brandos, ocasionalmente sintomatologia nervosa, mas com baixa mortalidade. Lentogênico ou vacina!. Apresenta infecções respiratórias brandas ou subclínicas. Entérico assintomático. Consiste usualmente em infecção entérica subclínica. A classificação desses patotipos raramente é vista no campo, uma vez que essas descrições referem-se a observações em aves SPF inoculadas com os respectivos patotipos. Ainda, em nível de campo, sinais clínicos observados em aves infectadas por estirpes lentogênicas podem ser exacerbados com infecções por outros microrganismos, ou quando condições adversas ambientais estão presentes. HOSPEDEIROS O VDN tem sido declarado como agente infectante em várias espécies animais. Além de aves, o VDN pode infectar diversas espécies de répteis, principalmente serpentes, e mamíferos, entre os quais, o homem. Em aves, já está definido que o VDN é capaz de infectar, experimental ou naturalmente, mais de 241 espécies de aves, representando 27 das 50 ordens de aves existentes (Tabela 18.1). PANZOOTIAS A história da doença de Newcastle é marcada por, no mínimo, três grandes panzootias, no entanto, é difícil dizer precisamente como e quando a DN emergiu, e determinar o período em que cada panzootia se difundiu. A primeira se iniciou com a emergência da D N, em 1926, e sua difusão para a maioria dos países do mundo. A difusão da doença, nos diferentes países, variou consideravelmente. Na Inglaterra, a doença desapareceu em 1928, na Ásia e Oriente Médio a DN se difundiu de1926 a 1942; pata o resto da Europa, África e América, a difusão da amostra asiática, ou de Doyle, parece ter ocorrido um pouco mais tarde, entre 1940 e 1950. A segunda panzootia da DN parece ter surgido no final de 1960 no Oriente Médio. Nesta, a difusão foi consideravelmente mais forre que a primeira, atingindo todos os continentes e muitos países até o ano de 1973. Essa rápida difusão estava associada ao grande comércio de espécies de psitacídeos, principalmente da América do Sul, América Central e Sudeste da Ásia, envolvendo o transporte aéreo. A terceira panzootia emergiu inicialmente no Oriente Médio, em 1970, onde foi relatada principalmente como uma doença neurotrópica em pombos de competição, causada por uma amostra de VDN distinguível das outras amostras por anticorpos monoclonais e chamada de pigeon type (PPMV-l). A principal forma de difusão deu-se por meio de exposição e comercialização de pombos, e sua presença foi confirmada em mais de 20 países, entre os quais muitos países europeus, no Canadá, EUA, Hong-Kong e Sudão. Em alguns países, a doença acometeu outras aves silvestres e a avicultura comercial. Na Inglaterra, em 1984, essa amostra viral foi responsável por 20 surtos da doença em frangos de corre, como resultado da contaminação de ração farelada por pombos infectados, que viviam na fábrica de ração. A história indica que, de tempos em tempos, amostras do VDN emergem de fomes desconhecidas por razões incertas e elas têm a capacidade de se difundir por todo o mundo por meio de aves suscetíveis. O uso profilático de vacinas preveniu, em muitos países, a emergência e a difusão de novas panzootias, mas existem evidências do isolamento do vírus virulento em aves exóticas, e surtos da doença em aves domésticas, de algumas parte do mundo, em razão de relaxamento na política de controle. A DOENÇA NO BRASIL O histórico do problema, no Brasil, começou com o aparecimento do primeiro surto da DN em Belém e Macapá, território do Amapá, em 1953, e sua introdução ocorreu, aparentemente, por conta da importação de carcaças congeladas de aves procedentes dos Estados Unidos da América do Norte para um dos hotéis da capital paraense. Posteriormente, foram assinalados surtos nos Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. Após o primeiro impacto, na década de 1950, a DN, embora endêmica, foi observada apenas esporadicamente, acometendo plantéis de pequena expressão econômica, controlando-se rapidamente os focos por meio de vacinação e medidas profiláticas complementares. Na década de 1970, constatou-se o ressurgimento da doença de Newcastle sob uma forma altamente parogênica, conhecida como Newcastle viscerotrópica. De tal forma que, no período de 1970 a 1975, foram diagnosticados aproximadamente 1.350 focos dessa doença e, em 1972, ocorreu o maior número de focos, cerca de 564. Em 1975, foram observados 173 focos envolvendo aproximadamente 1.300.000 aves enfermas. No período de 1971 a 1979, a doença de Newcastle (9,8% de prevalência) constituiu-se no terceiro problema sanitário mais freqüente para a avicultura de corte de Minas Gerais e outros Estados da Federação. Entre 1975 e 1980, a doença de Newcascle (10,68% de prevalência) constituiu-se no segundo problema sanitário mais freqüente para a indústria avícola (reprodutoras, poedeiras e frangos de corte) de Minas Gerais e outros 14 Estados da Federação. No ano de 1983, foram oficialmente notificados 218 focos da doença de Newcastle, com um comprometimento de aproximadamente 60.000 aves. Entre 1984 e 1987, a DN foi notificada em 1.074 focos comprometendo 401.108 aves. Em 1984, 74,52% dos casos foram notificados no Rio Grande do Sul, comprometendo 75.541 aves. Já no ano de 1987, o estado de Sergipe foi o responsável por 84,98% dos casos notificados, comprometendo 34.300 aves. os anos de 1988 e 1989, houve uma redução significativa no número de focos da DN, totalizando 399 focos, comprometendo 227.648 aves. Em 1990, no Estado de Minas Gerais, foram notificados 46 focos da DN, acometendo 245.803 aves. O Estado do Paraná, no ano de 1991, foram notificados dois focos da doença de Newcastle, acometendo 43.300 aves. No biênio 1992-1993, foram notificados 132 focos, comprometendo 70.447 aves. Nesse período, o Estado de Minas Gerais foi novamente o mais atingido, sendo em 1992, responsável por 98,89% dos casos, totalizando 66.800 aves acometidas e, em 1993, no mesmo Estado, a doença foi notificada em 64,26% dos focos, comprometendo 2.313 aves. No ano de 1994 foram notificados 63 focos da DN, acometendo 2.539 aves, sendo 1.010 no Estado do Piauí, 650 aves no Paraná e o restante distribuído em seis outros Estados da Federação. o período de 1995 a 1999 foram notificados 17 focos da doença de Newcastle, acometendo 582 aves. Esse baixo número de aves acometidas, nesses focos, indica o comprometimento apenas de aves de fundo de quintal, ou seja, nesse período não foi notificado foco da doença de Newcascle em criações comerciais no Brasil. No ano de 1997, o episódio do isolamento do VDN no Estado de São Paulo, em avestruzes importadas, não foi considerado foco da doença. Da mesma forma, em 1999, no Estado do Paraná, foi isolado VDN de aves exóticas importadas, principalmente psitacídeos e palmípedes, e também não foi considerado foco nacional, por se tratar de aves importadas. Em ambas ocorrências, todas as aves importadas e possíveis contatos foram sacrificados e desrruídos para evitar a disseminação do VDN. Nos anos de 2000 e 2001, ocorreram episódios isolados da doença nos Estados do Rio de Janeiro e Goiás, respectivamente, onde foram realizadas todas as medidas de eliminação dos focos, que em ambas as situações não se caracterizaram como áreas de produção comercial (Tabela 18.2). No Estado do Rio de Janeiro (2000) foram notificados três focos no Município de São José do Vale do Rio Preto. Tratava-se de pequenas propriedades de frango de corte, não vinculadas ao sistema de integração com a indústria, tendo como finalidade o abastecimento do mercado local. A região de ocorrência dos focos se caracteriza por áreas montanhosas e rios, sendo esses fatores limitantes à disseminação do vírus para outras regiões. Nesse episódio, foi identificado o vírus da doença de Newcastle, APMV-1, com índice de patogenicidade intracerebral de 1,66 e 1,69. Em maio de 2001, foram registrados três focos, no Município de Nova Roma, GO. Os focos ocorreram em propriedades rurais de subsistência sem expressão comercial, localizadas em região de assentamento de trabalhadores sem terra. A avicultura industrial de expressão comercial de exportação de frango de corte no Estado de Goiás está localizada no município de Rio Verde a 619km e no Distrito Federal distante 242km da área afetada. O agente identificado foi o vírus da doença de Newcasde, APMV-1, com índice de patogenicidade intracerebral de 1,6l. Em ambas, as situações de emergência foram adotadas todas as medidas previstas na legislação sanitária brasileira, pela Portaria SDA nQ 183/94, e as preconizadas nas normas internacionais, estabelecidas pelo Código Zoossanitário Internacional, da OIE. Vale ressaltar que, até o ano de 1996, na maioria dos focos da doença de Newcastle notificados ao Ministério da Agricultura, não foram realizados diagnóstico laboratorial e confirmativo, sendo notificados apenas com base nas suspeitas clínicas e isolamento viral, sem a respectiva caracterização do agente e, portanto, em alguns dos focos notificados, o VDN patogênico poderia não estar presente. DIFUSÃO A transmissão do VDN por contato por meio de produtos contaminados, ou por aerossóis de aves infectadas, é uma das principais formas de difusão do agente da DN. Aves apresentando sintomas respiratórios excretam vírus em aerossóis, que podem ser inalados por aves suscetíveis. Da mesma forma, como esse vírus também se replica em nível intestinal, pode ser difundido por fezes contaminadas, mediante sua ingestão direta, ou indiretamente pela ingestão de ração ouágua contaminada ou, ainda, pela inalação de pequenas partículas produzidas pelas fezes secas. Alguns animais, principalmente pequenos roedores, insetos e artrópodes, que transitam entre aves infectadas e aves suscetíveis, podem representar um potencial para a difusão da DN, transmitindo mecanicamente o vírus. O movimento de pessoas com seus calçados, roupas e veículos, bem como o transporte de equipamentos entre granjas contaminadas e suscetíveis, constituíram o método de difusão mais importante na Califórnia, durante a segunda grande panzoona. Merece destaque na difusão da DN, a comercialização entre regiões e/ou países, devido à elevada resistência do vírus, a temperatura de congelamento e o comércio de produtos e subprodutos de aves abatidas para consumo, durante surtos da doença. Além disso, subprodutos de aves infectadas e utilizadas como matérias-primas para rações têm sido um método comum de difusão do vírus. Durante a terceira grande panzootia, dados epizootiológicos confirmaram que a maioria dos surtos, ocorridos na Inglaterra, estava diretamente ligada à ração originada de fábricas que eram habitadas por populações de pombos infectados. Até o momento, não existe comprovação científica de que o VDN possa ser difundido por meio de ovos de galinhas infecradas. Por outro lado, a infecção e morte do embrião podem ocorrer durante os primeiros 4 ou 5 dias de incubação de ovos naturalmente infectados. EVOLUÇÃO DA DOENÇA O período de incubação do VDN pode ser de até 15 dias, com média de 2 a 6 dias. Em galinhas suscetíveis, o surto da DN pode ser extremamente grave, em que 100% das aves afetadas morrem em até 72h sem apresentar qualquer sinal clínico. Pombos podem apresentar mortalidade de até 80%, enquanto canários geralmente apresentam doença branda, com baixa mortalidade, a perdiz (Rhynchotus ruftscens) não apresenta sinais clínicos, nem mortalidade quando infectada, experimentalmente com VDN patogênico; mas essa espécie, quando infectada, é capaz de difundir o VDN para galinhas SPE Geralmente não existe infecção persistente em aves domésticas. Em psitacídeos pode-se desenvolver uma infecção crônica em nível renal com potencial de eliminação de partículas virais por longo período. PATOLOGIA Não existem lesões patognomônicas para qualquer uma das formas da doença de Newcastle. Vírus que apresentam baixa patogenicidade produzem infecções clinicamente inaparentes com ausência, ou um mínimo de lesões, enquanto outros patotipos produzem sinais clínicos variados da doença. Estirpes patogênicas do VDN podem causar anorexia, depressão, respiração acelerada, descarga nasal e ocular, conjuntivite, rinite, estertor, dispnéia, ataxia, convulsões e tremores em todas as idades de aves, além de acentuada queda na produção de ovos. À necropsia podem ser observados edema da cabeça, região do pescoço, periuaqueal e entrada do tórax, hemorragias e ulcerações na laringe, turvação dos sacos aéreos e inflamação da uaquéia, culminando com destruição do epitélio uaqueal e hemorragia (Figs. 18.1 e 18.4). Freqüentemente são observadas hemorragias no coração e aumento do volume do saco pericárdico. No trato digestivo, hemorragias petequiais na mucosa do proventrículo e, no intestino, são freqüentem ente observadas (Fig. 18.4). Nesse último órgão, às vezes observa-se hemorragia em seu lúmen e até inflamação acentuada na mucosa da cloaca. Na maioria dos casos, observa-se diarréia verde-brilhante ou sanguinolenta. Ainda pode ocorrer peritonite serofibrinosa e petéquias no peritônio. Sinais nervosos marcantes, como torcicolos, uemores bem como paralisias das pernas e asas. Usualmente ocorrem após os outros sinais clínicos serem observados e freqüentemente terminam em morte. Lesões microscópicas podem variar consideravelmente e também podem apresentar pequeno valor no diagnóstico da DN. O patotipo mais patogênico do VDN pode causar lesões necróticas acompanhada de hemorragia na maioria dos órgãos infectados. Quando ocorre envolvimento do uato respiratório pode-se observar inflamação, infiltrado celular e hemorragia na traquéia e, às vezes, lesões proliferativa e exsudativa nos pulmões. Na forma mais branda da doença, podese observar infiltração linfocitária nos sacos aéreos, pulmões e traquéia. Quando observamos sinais clínicos nervosos, o exame microscópico do sistema nervoso central apresenta degeneração neuronal, agregado perivascular de células linfocíticas e proliferação das células endoteliais. A mortalidade com as estirpes patogênicas pode, rapidamente, exceder 90% em galinhas e perus, porém, em algumas espécies de aves silvestres, como: mainás, lóris, perdiz, avestruz e a maioria dos psitacídeos e aves domésticas, como: patos e gansos, a infecção pode não apresentar qualquer sintomatologia. DIAGNÓSTICO o isolamento viral e a posterior caracterização é o único método seguro de diagnóstico da doença de Newcastle. SINAIS CLíNICOS Os sinais clínicos descritos para a DN são muito parecidos ou idênticos a outras doenças infecciosas, como: bronquite infecciosa, laringotraqueíte, coriza, doença crônica respiratória, entre outras, que causam principalmente sintomas digestivos e respiratórios, indistinguíveis da DN, portanto, sinais clínicos isoladamente não apresentam uma base confiável para o diagnóstico da DN. As estirpes dos vírus da doença de Newcastle podem ser agrupadas em patotipos com base nos sinais clínicos em galináceos. No entanto, outros fatores também são importantes para estabelecer a patogenicidade do vírion da DN, como: além dos galináceos, infecções de ourras espécies, idade, estado imune, co-infecção por outros agentes, estresse, via de exposição e dose do vírus. A doença causada por uma amostra de vírus extremamente patogênica pode aparecer repentinamente, culminando com alta mortalidade, às vezes, na ausência de outros sinais clínicos. Surtos com o pato tipo velogênico viscerotrópico do VDN iniciam-se com apatia, alterações respiratórias, debilidade, finalizando com prostração e morte. Pode ainda ocorrer edema ao redor dos olhos e da cabeça. Diarréia esverdeada é freqüentemente observada em aves no início da infecção e anteriormente à morte. Em aves suscetíveis, a mortalidade freqüentemente chega a 100%. As aves acometidas por vírus velogênicos neurotrópicos apresentam doença respiratória grave (Fig. 18.2), acompanhada por sinais neurológicos (Fig. 18.3). A produção de ovos se reduz drasticamente. A morbidade pode chegar a 100%, mas a mortalidade é geralmente considerada próxima de 50% em aves adultas e de até 90% em aves jovens. As amostras mesogênicas do VDN usualmente causam doença respiratória em nível de campo. Em aves adultas, observa-se marcante redução da produção de ovos que pode se estender por semanas. Sinais nervosos podem ocorrer, mas não são freqüentes. A mortalidade apresenta-se baixa, exceto em aves suscetíveis e/ou aves que apresentam infecções concomltantes. A infecção de algumas espécies de aves silvestres com vírus patogênicos pode não mostrar qualquer sintomatologia clínica, porém, essa espécie animal pode difundir o VDN para planteis suscetíveis. Os vírus lentogênicos da DN não causam doenças em aves adultas. Em aves jovens, suscetíveis, uma doença respiratória branda a moderada pode ser observada, às vezes como resultado da infecção com uma amostra mais patogênica, como a amostra vacinal LaSota, ou estirpes, cujo IPIC aproxima-se de 0,7, sendo agravada principalmente com infecções secundárias, podendo ocorrer mortalidade. A vacinação ou infecção de frangos de corte suscetíveis, dias antes do abate, com essas estirpes de vírus, pode levar à colissepticemia com aerossaculite, resultando em condenações no abatedouro. Na Dinamarca, durante o período de quarentena de avestruzes importadas, 18 de 76 aves de 3 a 4 meses de idade morreram sem apresentar sinais clínicos de doença e nenhuma morte foi relacionada à doença infecciosa. Porém, uma estirpe do VDN altamente patogênico foi isolada de amostrasde intestinos colhidas das carcaças. INFECÇÃO EXPERIMENTAL A progressão e o resultado de infecções experimentais, envolvendo o APMV-l, difere em várias espécies de aves domésticas e silvestres. Esses resultados variam principalmente com a idade, estado imune, via de inoculação, dose do inóculo e se a inoculação experimental ocorreu em ambiente aberto ou em ambiente controlado (isoladores). Galinhas e perus suscetíveis, em inoculações experimentais com vírus patogênico, podem apresentar mortalidade de 100%, às vezes, sem apresentar qualquer sintomatologia da doença. Esse mesmo pato tipo pode apresentar baixa, ou nenhuma, mortalidade em palmípedes, pombos e psitacídeos. Aves, como mainás e canários, inoculadas com VDN patogênico não apresentaram qualquer sintomatologia da doença, mas a taxa de mortalidade foi de 21 %. Em avestruzes, dois grupos de aves com 14 meses de idade foram inoculados com VDN patogênico, sendo um deles inoculado por via intravenosa com 109 D LEso e o outro, por via oral com 2 x 109 DLEso' Apenas o grupo de aves inoculadas por via intravenosa apresentou tosse produtiva, depressão e mortalidade de 25%. O grupo de aves inoculadas por via oral não foi observado qualquer sinal clínico de doença, nem mortalidade e as aves apresentaram baixo nível de anticorpos contra o VDN. Em perdizes inoculadas experimentalmente em isoladores com 108 DLEso de VDN patogênico via oral, não apresentou qualquer sintomatologia nem mortalidade, mas o vírion foi reisolado até 12 dias após a inoculação. Aves SPF, que coabitaram o mesmo ambiente se infectaram e morreram, apresentando lesões sugestivas da doença, demonstrando o caráter de portador das perdizes. Na mesma linha de pesquisa, outras espécies de aves foram pesquisadas com o objetivo de avaliar o caráter de portador do VDN. Assim, a galinhad' angola, o pato e o marreco doméstico demonstraram ser resistentes ao desafio experimental com vírus patogênico da DN, sem apresentar qualquer sintomatologia nem mortalidade, entretanto o VDN pode ser reisolado de suas fezes. Da mesma forma, esses vírus infectaram as aves SPF que coabitaram o mesmo ambiente e morreram. AMOSTRAS PARA ISOLAMENTO VIRAL o isolamento viral e a posterior caracterização é o único método seguro de diagnóstico da DN. Portanto, quando um lote apresentar doença respiratória e/ou digestiva grave acompanhada de alta mortalidade e lesões sugestivas da DN, é necessário tentar isolamento viral de aves mortas recentemente ou de aves apresentando sintomatologia. Amostras de aves monas poderão consistir de suabes oronasais, assim como de amostras colhidas à necropsia, como pulmão, rins, intestinos (incluindo conteúdo), proventrículo, baço, cérebro, fígado e coração. Esses materiais podem ser colhidos separadamente ou em po04 em que amostras procedentes de intestinos e proventrículo (materiais mais contaminados) são usualmente processadas separadas dos outros materiais. Amostras de aves vivas devem incluir suabes traqueais e cloacais, que devem apresentar conteúdo fecal. Em aves delicadas, de pequeno pone, que podem morrer duralite a colera de suabe, fezes frescas podem ser uma alternariva adequada. As amostras colhidas para diagnóstico da DN devem ser colocados em solução salina ramponada (PBS), com pH 7 a 7,4, contendo amibióticos. As concentrações dos antibióticos devem variar de acordo com as condições locais, mas podem ser, por exemplo: penicilina (2.000UI!mL); estreptomicina (2mg/mL); gentamicina (50mg/mL) e micosrarina (l.OOOUI! mL) para tecidos e suabes traqueais, deve apresemar concentrações cinco vezes maiores para fezes e suabes cloacais. É importame ajustar o pH para 7 a 7,4 após a adição dos amibióticos. Fezes e tecidos devem ser colocados, obedecendo a quamidade de 10 a 20% em relação à q uantidade da solução de antibiótico. Se o material colhido não for processado de imediato (até 1 a 2h após a coleta), esse pode ser mantido a 4°e por até 4 dias, ou ser congelado a 200e por um período indeterminado. CULTURA VIRAL Os recidos devem ser picotados em finas partículas e macerados. A seguir, esse material e também os materiais de fezes devem ser clarificados por cemrifugação em 1.000g por aproximadameme 10min. Esse procedimento pode ser realizado até à temperatura ambiente, desde que a temperatura não exceda 25°C, e o sobrenadante deve ser colhido e armazenado sob refrigeração por até 4 dias, quando então, uma quantidade entte 0,1 e 0,3mL deve ser inoculado na cavidade alantóide de, no mínimo cinco, ovos SPF embrionados de 9 a 11 dias de incubação. Após a inoculação, os ovos devem ser incubados a 35 a 37°C por um período de 4 a 7 dias. Os ovos devem ser avaliados diariamente e os ovos, contendo embriões mortos durante as primeiras 24h devem ser descartados. Os ovos contendo embriões mortos e todos aqueles que permanecerem vivos até o período final de incubação devem ser resfriados a 4°C por, no mínimo 4h e o líquido alantóide de cada ovo deve ser testado quanto à sua atividade hemagl utinante (Fig. 18.5). Fluidos alantóides que apresentarem resultado negativo devem ser colhido (podendo ser em pool de cada material) e inoculado em mais uma série de ovos SPE O material suspeito somente poderá ser considerado como negativo após três passagens consecurivas em ovos SPF e, em todas elas, não se observar atividade hemaglutinante. IDENTIFICAÇÃO VIRAL A atividade hemaglutinante pode ser causada por bactérias presentes ocasionalmente no líquido alantóico. Esta contaminação deve ser confirmada por culturas bacteriológicas. Se há presença de contaminação bacteriana, o líquido alantóico deve ser filtrado com uma membrana de 450nm e/ou tratado com antibióticos, antes de sua reinoculação nos ovos embrionados (Fig. 18.6). A atividade hemaglutinante de líquido alantóide estéril para bactéria pode ser em razão da presença de um dos 15 subtipos hemaglutinantes do vírus da influenzaA (Orthomyxovirus) ou de um dos oito soro tipos de paramixovírus aviários hemaglutinantes. Lembramos que o APMV-5 não é hemaglutinante, entretanto, a sua identificação deve ser realizada por meio de teste de neutralização viral com anti-soro de referência. O vírus da doença de Newcasde pode ser confirmado pelo uso de anti-soro específico no teste de inibição da hemaglutinação, ou no teste de neutralização viral. Usualmente é utilizado anti-soro preparado em galinhas SPF com uma estirpe vacinal do VD N. No teste de HI podem ocorrer reações cruzadas principalmente entre o APMV-l e o sorotipo APMV-3. Para sua interpretação há necessidade de se trabalhar com antígenos padrões e anti-soros, positivo e negativo, controles. íNDICES DE PATOGENICIDADE A grande vatiação na virulência dos diferentes isolados do VDN, aliada ao uso freqüente de vacinas vivas, indica que o isolamento de um VDN de aves, aptesentando ou não sintomas clínicos, não confirma o diagnóstico da doença de Newcasde. Dessa forma, deve-se avaliar o índice de patogenicidade da estirpe isolada (definição de doença de Newcasde). Alguns pesquisadores estão desenvolvendo testes in vitro para analisar a base molecular de patogenicidade do VDN, mas ainda hoje a avaliação da patogenicidade é baseada em pelo menos um dos seguintes testes in vivo: IPIC (conforme a definição da doença de Newcasde), tempo médio de morte embrionária (TMME) e índice de patogenicidade intravenosa (IPIV). íNDICE DE PATOGENICIDADE INTRACEREBRAL A partir do líquido alantóico infectivo, com título em hemaglutinação (HA) maior que 24 (1: 16), deve ser diluído a 1: 1 O em salina isotônica estéril, sem aditivos, e a partir daí, inocular 0,05mL, por via intracerebral, em 10 pintos SPF, de 1 dia de idade. Consideram-se pintos de 1 dia, pintos que tenham entre 24 e 40h de vida. Deve-se examinar os pintos, a cada 24h, por um período de 8 dias. Em cada dia, as aves devem receber uma das seguintes pontuações: pintos saudáveis = O; pintos doentes = 1; pintos mortos = 2. As aves mortas devem receber pontuação 2, diariamente apósa morte, até o final teste. O índice de patogenicidade intracerebral (IPIC) é a pontuação média recebida por ave, por dia, durante o período de 8 dias. Nas amostras do VDN mais patogênicas, esse índice se aproxima de 2, enquanto, para as estirpes vacinais, este índice Xl ~, se aproxima de O. ~ Lembramos que a definição mais recente da DN é: uma ~ infecção de aves causada por um vírus do sorotipo Paramy~ xovirus aviário tipo 1 (APMV-l), que apresente IPIC maior Xl do que 0,7. TEMPO MÉDIO DE MORTE EMBRIONÁRIA Após realizar diluições decimais, na faixa de 10-6 a 10-9 do líquido alantóico infectivo, em solução salina, inocular 0,1 mL, de cada diluição em, no mínimo, 5 ovos SPF embrionados, com 9 a 11 dias de incubação, pela via alantóide e incubar os ovos a 37°C. Deixar uma amostra do mesmo líquido alantóico na geladeira (4°C) por 8h e depois inocular O,lmL de cada diluição em, no mínimo, 5 ovos da mesma idade e incubar a 37°C. Os ovos devem ser observados durante 7 dias, duas vezes ao dia, e os dados de mortalidade embrionária devem ser registrados. A dose letal mínima é a maior diluição capaz de matar todos os embriões. O tempo médio de morte embrionária (TMME) é o tempo médio, em horas, para a dose letal mínima matar todos os embriões e se classifica em: Velogênica. Menos de 60h para matar. Mesogênica. Entre 60 e 90h para matar. Lentogênica. Mais de 90h para matar. Índice de patogenicidade Intravenosa Esse índice é calculado a partir da inoculação intravenosa em frangos SPF, com 6 semanas de idade. São inoculados 10 aves, pela via intravenosa, com 0,1 mL do líquido alamóico infectivo, com título de HA maior que 24 (1: 16), diluído aI: 10 em salina isotônica estéril isenta de aditivos. Deve-se examinar as aves, a cada 24h, por um período de 10 dias. Em cada dia, as aves devem receber uma das seguintes pontuações: ave saudável = O; ave doente = 1; ave patalítica = 2; ave morta = 3. As aves mortas devem receber pontuação 3, diariamente após a morte, até o final teste. O índice de patogenicidade intravenosa (IPIV) é a pontuação média recebida por ave, por dia, durante o período de 10 dias. Amostras lentogênicas e algumas mesogênicas apresentam IPIV O, enquanto amostras patogênicas o IPIV se aproxima de 3. TESTES SOROLÓGICOS Em áreas onde não se utilizam programas de vacinação, e ou, em áreas onde a DN está erradicada, os testes sorológicos podem ser utilizados como meio de diagnóstico, visto que dificilmente reações positivas serão inespecíficas, porém os resultados positivos podem não indicar doença, mas sim infecção por VDN. O VDN pode ser empregado como antígeno em uma ampla variedade de testes sorológicos, neutralizações e no ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA). Até o momento, o teste de inibição da hemaglutinação (HI) é o mais utilizado. Neste teste, o soro de galinha raramente apresenta reação inespecífica positiva e não há necessidade de realizar tratamento prévio do soro. Soros de outras espécies, às vezes podem causar hemaglutinação de hemácias de galinhas, portanto essa propriedade deve ser inicialmente removida pela inativação a 56°C por 30min e por meio de adsorção do soro com hemácias de galinhas. Isso é feito mediante adição de 0,025mL de hemácia de galinha concentrada para cada 0,5mL de anti-soro, agitar levemente e deixar em repouso por 30min; após, a solução deve ser centrifugada a 800g por 2 a 5min e o soro adsorvido colhido. Variações nos procedimentos para os testes de HA e HI podem estar sendo realizados em diferentes laboratórios. A seguir, será descrita uma metodologia aceita internacionalmente em que os resultados podem ser comparáveis. Devemse utilizar microplacas com 96 cavidades, com fundo em "U" ou em "V", em que o volume final para ambos os testes seja 0,075mL. Os reagentes necessários para esse teste são solução salina isotônica - PBS (O, 1M), pH 7 a 7,2 e hemácias colhidas de, no mínimo, três aves SPF, utilizando-se como anticoagulante solução de Alsever. Na impossibilidade de colher sangue de aves SPF, pode-se utilizar galinhas não vacinadas monitoradas regularmente e se apresente livres de ancicorpos para o VDN. A suspensão de hemácias deve ser la\"ada três vezes em PBS antes do uso, na concentração de 1 %. Devemse utilizar controles positivos e negativos do anrígeno e do anti-soro para validar o teste. TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO · Colocar 0,025mL de PBS em cada uma das cavidades da microplaca a ser utilizada.
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