Proteina 3

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Bioquímica
Purificação de proteínas
 
Estratégia geral
- Liberação da proteína do material biológico
- Podem ser separados por fracionamento celular
- Pode-se separar proteínas por características:
Solubilidade
Tamanho
Carga elétrica
Afinidade
- Normalmente o primeiro passo de separação da proteína 
bruta é a adição de sais (sulfato de amônio) ou solventes 
orgânicos miscíveis com água
Separação por diferença de solubilidade
 
Solubilidade da -lactoglobina em função do pH em 
diferentes concentrações de NaCl
 
Estratégia geral
- Devem-se seguir técnicas para separação parcial
ex. Cromatografia
Eletroforese
- Faz-se importante métodos para detectar e quantificar a 
proteína de interesse
- Por tecnologias de DNA recombinante é possível obter a 
proteína desejada em maiores quantidades
 
Centrifugação diferencial
 
Densidade e coeficiente de sedimentação
 
Centrifugação por gradiente linear
Formação do gradiente 
de densidade
ex. Alta d. 20% sacarose
Baixa d. 5% sacarose
Pode ser realizada em condições 
não desnaturante, preservando a 
estrutura nativa
 
A diálise pode separar moléculas grandes
 Cromatografia de exclusão - filtração em gel
Dextrana
 Cromatografia de exclusão -filtração em gel
 
Material comumente utilizado na filtração em gel
 
Cromatografia de troca iônica
Moléculas com a mesmo sinal de carga da resina selão 
eluídas primeiramente – escolhe-se o pH e a concentração 
salina desejada
 
Cromatografia de troca iônica
 
Cromatografia por afinidade
Muitas proteínas ligam-se 
específica e não-covalentemente 
 a certas moléculas (enzimas, 
hormônios, anticorpos)
- 1o: ligar a molécula que a 
proteína tem afinidade a uma 
matriz insolúvel (ex. Agarose)
- 2o: passar a proteína (será 
adsorvida)
- 3o: Eluir a proteína com adição 
concentrada de ligante
 
High-Pressure Liquid Chromatography
 
High-Pressure Liquid Chromatography
 
High-Pressure Liquid 
Chromatography (HPLC)
Filtração em gel por HPLC 
define individualmente as 
proteínas devido sua grade 
resolução:
(1) thyroglobulin (669 kd)
(2) catalase (232 kd)
(3) bovine serum albumin (67 kd)
(4) ovalbumin (43 kd)
(5) ribonuclease (13.4 kd)
 
Eletroforese
Em um mesmo pH as proteínas apresentarão cargas 
diferentes
A aplicação de um campo elétrico poderá separá-las
Uso de um meio sólido: papel ou gel (evita 
movimentação por convecção)
 
Eletroforese em papel
-Aplicação da em tira de papel ou acetato de celulose
- As extremidades são imersas em tampão
Distintos reservatórios
- Aplica-se uma ddp específica
- As proteínas migram em direção à carga oposta em 
velocidades proporcionais às suas cargas
- Revelação por coloração específica
 
Eletroforese em papel
 
Eletroforese em gel
Muito utilizado para mistura de proteínas ou outras 
macromoléculas
Gel suporte: Agarose ou poliacrilamida
Podem ter porosidade variável
Separam por carga e por tamanho
As proteínas menores migram mais rápido que as 
maiores, formando bandas
Visualização por coloração específica
 
Eletroforese em gel
SDS-Page
Uso da Poliacrilamida em presença de SDS
- O SDS liga-se a radicais hidrofóbicos das proteínas
Ocorre a desnaturação
- Padrão geral: uma molécula SDS (dodecil sulfato de 
sódio) a cada dois resíduos de aminoácido
- Atribui carga negativa a proteína, mascarando a 
carga intrínseca da proteína nativa
 
Eletroforese em gel
 
Eletroforese em gel
 
 
 
Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional
Separação pelo ponto isoelétrico
 
Alto pH
_
Alto pH
_
Baixo pH
+
Baixo pH
+
Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional
1) Separação pelo ponto isoelétrico
 
Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional
Primeira dimensão
pI
Segunda dimensão
tamanho
Proteínas de um 
mesmo pI são 
separadas
Por seu tamanho
 
Gel de eletroforese bi-dimensional
 
Análise eletroforese SDS-Page das etapas de 
purificação de uma proteína
 
 
Determinação da Massa
ESPECTROMETRIA DE MASSA COM 
ELETRONEBULIZAÇÃO
- Espectrometria de massa com nebulização: electrospay)
- A amostra de proteína em solvente ácido volátil é 
nebulizada em espectrofotômetro de massa
- Na câmara de vácuo
As gotículas evaporam deixando as moléculas 
desnudadas e não fragmentadas de proteínas com 
múltiplas cargas positivas
- As moléculas são aceleradas em campo elétrico e 
desaceleradas com um campo magnético
 
MALDI-TOF Mass 
Spectrometry. 
(1) A amostra de 
proteína é ionizada 
(2) Um campo elétrico 
acelera os íonn para o 
detector 
(3) Os íons menores 
chegam primeiro 
(4) O pulso do laser de 
ionização também 
desencadeia um relógio 
que mede o tempo da 
trajetória dos íons 
(TOF)
 
Espectro de massa (MALDI-TOF) da Insulina e 
β-lactoglobulina
 
Detecção de proteínas por immunoblotting
 
Como conhecer a estrutura de proteínas
Cristalografia de Raios X
Imagem da difração de raios X da proteína
- É necessário obter o cristal da proteína
Técnica conhecida por cristalografia
- Inicio com amostra concentrada de proteína
- Formação do cristal (por agentes químicos)
- No cristal: água reduzida/ moléculas ordenadas
CADA PROTEÍNA POSSUÍ UM PADRÃO DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X
 
Cristalização da Mioglobina
Sulfato de amônio
 
Cristalografia de Raios X
 
Cristal de Mioglobina
O salting ou lento favorece a formação de cristais
 
Raio X - Cristal de Mioglobina
 
Seção do mapa de densidade de elétrons da 
mioglobina
 
Como conhecer a estrutura de proteínas
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
A proteína fica em solução
A solução é colocada no espectrômetro de ressonância
A molécula é colocada sobre um forte campo magnético
São aplicados pulsos de radiofrequência que são absorvidos pelos 
núcleos dos átomos da molécula de proteína – exitando-os
Quando os núcleos retornam a forma basal, emitem de volta 
radiofrequências específicas de cada um dos átomos