Duplicação do DNA

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Genética II 2014 
GENÉTICA II 
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 
tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 
3602 3818 – sala 13, bloco 14 
 
 
Principles of Genetics, Simons and Snustad - 5th Edition 
Capítulo 10 
Assuntos abordados nesta aula: 
 
• Duplicação do DNA 
• Duplicação em procariotos 
• Duplicação em eucariotos 
 
MECANISMO RÁPIDO E PRECISO 
1 erro a cada 109 nucleotídeos incorporados 
I. INICIAÇÃO 
II. EXTENSÃO 
III. TÉRMINO 
Watson e Crick (1953) 
 Modelo da Dupla Hélice 
 Sugeria duplicação semi-conservativa 
Fitas velhas - molde 
Fitas novas 
Hipótese 1 
Semi-conservativa 
Hipótese 2 Hipótese 3 
Conservativa Dispersiva 
Conclusão do experimento: a duplicação do DNA é semi-
conservativa, ou seja, uma molécula de DNA cadeia dupla origina 
duas iguais, sendo que cada uma destas contém uma cadeia 
parental e uma recém-duplicada. 
Mecanismo de duplicação: baseia-se no 
pareamento complementar das bases na 
dupla hélice do DNA. 
A estrutura do DNA contém a informação 
necessária para perpetuar a seqüência das 
bases, que é característica para cada 
organismo. 
Para as fitas velhas funcionarem como molde, a dupla hélice precisa ser aberta 
John Cairns (1963): estudo da duplicação do DNA por autorradiografia 
•forma da letra  
•bulbo de duplicação 
Sentido da duplicação 
Bidirecional 
Unidirecional 
Pulsos de timidina H3 antes do 
término da duplicação : marcação 
radioativa visualizada nas duas 
forquilhas de duplicação 
Forquilha de 
duplicação 
Forquilha de 
duplicação 
A duplicação é bidirecional !! 
Seqüências de 13 pb 
Sítios de ligação da proteína DnaA 
Seqüências de 9 pb 
Ricas em AT 
Origem da replicação : Seqüência específica para ligação de proteínas 
iniciadoras (promovem abertura da dupla hélice) 
Menor gasto de energia para separar as fitas 
A sequência da origem é casual ou existe uma sequência consenso ? 
Replicon: unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de duplicação 
O genoma bacteriano circular constitui um único replicon 
 A velocidade da forquilha de duplicação bacteriana é 30.000pb/min 
 Uma única origem de duplicação em E.coli (OriC, 245 pb) 
Uma vez que a dupla hélice está aberta, como é feita a síntese da nova fita ? 
DNA polimerases 
Kornberg (1957) : DNA polimerase I 
Requerimentos da DNA pol I para sintetizar nova fita de DNA : 
 Deoxinucleotídeos trifosfatados 
 Íons Mg2+ 
 DNA pré-existente, para servir como molde 
 Uma extremidade OH-3’ de uma cadeia de DNA pré-existente para realizar a 
ligação fosfodiéster 
Funções da pol I : 
remove bases mal pareadas e degrada 
DNA dupla-cadeia 
três tipos de atividades enzimáticas: 
Polimerásica, direção 5’ 3’ 
Exonucleásica, direção 3’ 5’ 
Exonucleásica, direção 5’ 3’ 
Marilena
Realce
Iniciação da síntese  necessidade de um “primer” ou iniciador (DNA pol 
não inicia uma nova cadeia) 
 
Enzimas RNA polimerase ou primase  sintetizam um oligonucleotídeo de 
RNA (RNA primer) que fornece a extremidade 3’-OH 
Primer 
DNA pol I não consegue iniciar a síntese da nova fita – ausência de 
extremidade OH-3’ livre 
Primase : sintetiza oligonucleotídeo iniciador (primer) de RNA, fornecendo a 
extremidade OH-3’ livre para a DNA pol I 
 
5’ 3’ 
3’ 5’ 
Marilena
Realce
 Atividade exonucleásica 5’-3’ 
 Atividade exonucleásica 3’-5’ 
Algumas definições acerca das atividades enzimáticas : 
Nuclease : degrada ác. nucleico 
Exonuclease : cliva a partir das extremidades 
Endonuclease : cliva ligações internas 
Atividade revisora (proofreading) 
E. coli – 1 erro a ~ cada 109 bases adicionadas ou após mil eventos de 
replicação 
 DNA polimerase tem um sítio ativo que só se fixa quando as bases 
estão pareadas corretamente 
 DNA polimerase tem capacidade de verificar a fidelidade da 
replicação na cadeia nascente (proofreading) e corrigir os erros 
(atividades exonucleásicas) 
 Depois da replicação, existe um sistema de reparo que corrige 
qualquer erro de pareamento de bases 
Pareamento incorreto : 
• Geometria 
diferente 
 
• Não acomoda-se 
no sítio ativo da 
DNA pol 
DNA pol I 
Sítio ativo da atividade exonucleásica 
3’5’ (proofreading) 
Sítio ativo da atividade polimerase 
Forma rara da C 
pareia-se com A 
C na forma rara volta para a 
forma normal – pareamento 
inadequado 
Bloqueio da duplicação 
Pareamento errôneo localizado no sítio 
da atividade exonucleásica 
O nucleotídeo mal pareado é removido 
DNA pol reassume a 
atividade polimerase 
A atividade revisora 
da DNA pol 
(proofreading) 
Processividade : habilidade da enzima de repetir a sua função catalítica sem 
dissociar-se do seu substrato 
Definida pelo no médio de nt incorporados sem que a DNA pol se 
dissocie do DNA molde 
Para a DNA pol : 
Quanto mais nt a DNA pol incorpora sem se dissociar do seu substrato, maior a 
sua processividade 
DNA pol II : 
• Reparo do DNA 
• Atividade polimerase 5’-3’ 
• Atividade exonuclease 3’ – 5’ 
DNA pol III : 
• Possui várias subunidades 
• Atividade polimerase 5’- 3’ 
• Atividade exonuclease 3’ - 5’ 
DNA polimerase IV e V – envolvidas em diferentes processos de reparo 
As DNA pol diferem em processividade 
Como a polimerase dirige a síntese de ambas as cadeias de DNA na mesma 
direção, se a síntese ocorre no sentido 5’ 3’ ? 
 
Direção em que as 
fitas se estendem 
3’ 
3’ 
5’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
DNA pol só age no sentido 5’- 3’ !!! 
Direção em que as 
fitas se estendem 
3’ 
3’ 
5’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Reiji Okazaki (1960) 
Fita líder (contínua) 
Fita descontínua 
Fragmentos 
de Okazaki 
Holoenzima DNA polimerase III sintetiza ambas as cadeias simultaneamente! 
 
A holoenzima DNA pol III 
 
 
 
 
Núcleo catalítico mínimo 
Une os dois 
núcleos 
catalíticos 
Mantém a enzima 
ligada ao DNA 
 : polimerase 
 : proofreading 
Complexo 
“clamp-loading” 
Subunidade  : aumenta a processividade da DNA pol III 
Topoisomerase Helicase 
SSBs (single strand 
binding proteins) 
Ori C 
13 pb 9 pb 
Dna A une-se às 
repetições de 9 pb 
Formação de um 
complexo de Dna A 
Fitas se separam na 
região das repetições 
de 13 pb 
Dna C Dna B (helicase) 
Também precisa de 
um primer 
https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0 
https://www.youtube.com/watch?v=kAnnwPLXvFU 
DNA linear 
Grande extensão do genoma 
Empacotamento do DNA na estrutura cromossômica 
 
Peculiaridades no mecanismo de duplicação: 
 
- Origens múltiplas provavelmente inespecíficas 
- Velocidade 25 X menor do que em procariotos 
- Replicons múltiplos com bulbos bidirecionais 
- Duplicação é razoavelmente coordenada mas há defasagens entre os 
replicons 
- Mecanismo básico é semelhante ao de E.coli 
- Diferentes enzimas DNA polimerases sintetizam as cadeias “leading” e 
“lagging” 
- Término da duplicação: ação de enzimas telomerases 
- Fidelidade da síntese: mecanismo desconhecido; 
taxa de erro = 1 mutação/ 106 pb/ divisão celular 
- Metilação do DNA ocorre preferencialmente na citosina 
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2.000 pb/min 
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes 
 Fase S demora  6-12 h em células eucarióticas 
Genoma humano – ~ 10 mil locais de origem (maior velocidade de replicação) 
 
DNA 
polimerase 
     
Localização Nuclear NuclearNuclear Nuclear Mitocond. 
Função Iniciação 
da síntese 
Síntese de 
DNA 
Reparo Reparo Duplicação 
Atividade 
relativa 
~80% ? ? 10-15% 2-15% 
Massa (d) 300.000 170.230.000 250.000 40.000 180.300.00
0 
Subunidades
* 
4 2** 2 1 3 
3’-5’ 
exonuclease 
Não Sim sim Não Sim 
Dideoxi-
timidina 
Não tem 
efeito 
Não tem 
efeito 
Leve 
efeito 
 Inibição 
+ 
Inibição + 
Afidicolina Inibição + Inibição + Inibição 
+ 
Não tem 
efeito 
Não tem 
efeito 
*algumas subunidades são desconhecidas; 
** uma subunidade da pol  requer PCNA 
DNA pol  coopera com a 
primase na síntese do 
primer 
Livro : Genomes (Brown TA) 
Livro : Genomes (Brown TA) 
•Não é feita pela atividade exonucleásica 5’-3’ de alguma 
polimerase; 
 
•Realizada pela ribonuclease H1 (cliva o RNA em híbridos DNA-
RNA) e pela ribonuclease FEN-1. 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
3’ 
5’ 
3’ 
5’ 
DNA pol. 
3’ 
gap 
Perde-se um pedaço do 
cromossomo 
• Células normais 
somáticas: atividade 
telomerase não 
detectável; 
• Células cancerosas, 
transformadas, 
germinativas e células-
tronco: atividade 
telomerase considerável. 
• Correlações geralmente 
observadas: 
• Encurtamento telomérico 
e senescência 
• Manutenção do 
comprimento telomérico e 
câncer 
METILAÇÃO DO DNA 
 
Papel na regulação da expressão gênica 
DNA em genes transcricionalmente ativos 
  grau de metilação 
Genes ativos  estado hipometilado (maioria) 
 
DNA em genes transcricionalmente inativos 
 grau de metilação 
 
Metilação controla a transcrição de genes na 
eucromatina (em eucariotos) 
Grau de metilação  papel na regulação da 
acessibilidade da cromatina a enzimas de reparo 
Metilação na heterocromatina 
 
2 a 7% das citosinas são metiladas  ilhas CpG 
5’- mCpG - 3’ 
 
3’- GpCm - 5’ 
 
 correlação com falta de atividade gênica