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5920117 - Genética I I 2014 Transcrição gênica em procariotos Prof. Dr. Tiago Campos Pereira tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 3602 3818 – sala 13, bloco 14 Principle of Genetics 5th Edition - Cap 11 (págs 282 - 293). Snustad & Simons, Editora Wiley Assuntos abordados nesta aula: • Transferência da informação genética: dogma central da biologia molecular • Tipos de moléculas de RNA • Aspectos gerais da síntese de RNA • A RNA polimerase de procariotos: “holoenzyme” e “core enzyme” • Três passos da transcrição: iniciação, elongação e término. • Terminação dependente e independente da proteína rho Durante a transcrição, uma fita de DNA do gene é usada como molde para sintetizar um RNA complementar, denominado transcrito. Os transcritos que são traduzidos nos ribossomos são denominados RNAs mensageiros (mRNAs). Nos procariotos, o produto da transcrição – o transcrito primário – usualmente é equivalente ao mRNA. Marilena Nota porque nao tem introns no mRNA de procarioto, todas partes codificam, todas partes tem gene. Cinco diferentes tipos de moléculas de RNA executam papéis na expressão gênica: - RNAs mensageiros (mRNAs): responsáveis por carregar a informação genética armazenada no DNA aos ribossomos, onde serão traduzidos em proteínas. - RNAs transportadores (tRNAs): pequenas moléculas de RNA que funcionam como adaptadores entre os aminoácidos e os códons durante a tradução do mRNA. - RNAs ribossomais (rRNAs): são componentes estruturais e catalíticos dos ribossomos. - Pequenos RNAs nucleares (snRNAs): são componentes estruturais e catalíticos dos spliceossomos – as estruturas que realizam a excisão de íntrons. - MicroRNAs (miRNAs): pequenas moléculas de RNA fita simples que regulam negativamente a expressão gênica, impedindo a tradução ou promovendo a clivagem do mRNA. Marilena Nota ELES TEM forma de trevo e se dobram assim por pareamento de bases intramolecular. tem o anticodon Marilena Nota RNA ribossomal + proteinas= ribossomonullo ribossomo de eucarioto tem 4 rRNA + 80 proteinas e o de procarioto tem 3 rRNA+50 proteinas Marilena Nota spliceossomos sao estruturas macromoleculares. eles nunca deixam o nucleo. e interagem com cerca de 40 prot para poder excisar os introns DOS GENES NUCLEARES (ja que eles nunca saem do nucleo). O produto funcional final de um gene pode ser um RNA funcional ou uma proteína. - mRNAs: são traduzidos. Portanto, o gene cuja transcrição gera um mRNA possui uma proteína como produto funcional final (enzima, anticorpo, proteína estrutural, etc) - tRNAs, rRNAs, snRNAs e miRNAs: não são traduzidos. Portanto, o genes cuja transcrição gera algum destes transcritos possui um RNA como produto funcional final. Marilena Nota gene codifica, se determinada região do DNA não codifica nada eu não posso chamar de gene!!!! Marilena Nota a transcricao ocorre a partir de uma fita molde de DNA e ela poderia resultar em rRNA, mRNA, tRNA, etc, ou seja em um transcrito, massss... somente o mRNA tem como produto final uma proteina, os outros o produto final é o RNA. Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce Marilena Nota a regiao genica do DNA(onde o gene está contido) sofre transcricao, por meio de uma fita molde de DNA que resultara em uma molecula de RNA, o transcrito-tRNA,mRNA, snRNA, rRNA- vai ainda estar no nucleo e do nucleo ir para o citoplasma, exceto o snRNA (nunca sai do nucleo) este ultimo vai formar o spliceossomo juntamente com outras proteinas nucleares, cerca de 40, entao ele excisa os introns do transcrito primario. Se a informação genética está armazenada no DNA (núcleo) e a tradução ocorre no citoplasma, como estes genes controlam as sequências de aminoácidos das proteínas? A existência de um intermediário - o mRNA - foi documentado através de experimentos de pulse-labeling, pulse-chase e autorradiografia. Marilena Nota como esses genes que estao no nucleo controlam as sequencias de AA das proteinas que estao sendo produzidas no citoplasma? por meio do mRNA, que foi descoberto por esses experimentos citados no slide. Se uma célula crescendo em cultura é exposta a um elemento da composição do RNA, tal como 3H-citidina ou 3H-uridina por alguns minutos, a localização intracelular é determinada por autorradiografia: o RNA marcado está presente quase exclusivamente no núcleo. Contudo, se o curto período de exposição for seguido por um período de crescimento em meio não-radioativo, a maioria da radioatividade incorporada estará presente no citoplasma, evidenciando o transporte do RNA do núcleo para o citoplasma. Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce A síntese de RNA ocorre por um mecanismo similar ao da síntese de DNA, exceto pelos seguintes pontos: - os precursores são ribonucleosídeos trifosfatos ao invés de desoxiribonucleosídeos trifosfatos. ribonucleosídeo desoxiribonucleosídeo Marilena Realce Marilena Nota a diferenca entre os dois é que o ribonucleosideo tem uma hidroxila a mais. A síntese de RNA ocorre por um mecanismo similar ao da síntese de DNA, exceto pelos seguintes pontos: - os precursores são ribonucleosídeos trifosfatos ao invés de desoxiribonucleosídeos trifosfatos. - Apenas uma das fitas de DNA é usada como molde para a síntese de um RNA complementar em uma determinada região. A síntese de RNA ocorre por um mecanismo similar ao da síntese de DNA, exceto pelos seguintes pontos: - os precursores são ribonucleosídeos trifosfatos ao invés de desoxiribonucleosídeos trifosfatos. - Apenas uma das fitas de DNA é usada como molde para a síntese de um RNA complementar em uma determinada região. - Cadeias de RNA podem ser iniciadas de novo sem a existência de um primer. Marilena Realce A molécula de RNA produzida será: - complementar à fita molde de DNA e - idêntica à fita DNA não molde, exceto pelo fato que uridinas substituem timidinas A molécula de RNA produzida é chamada de “RNA senso” ou “RNA com sentido” (sense RNA) porque sua sequência nucleotídica faz sentido (makes sense) quando é traduzida, i.e., gera uma proteína. Uma molécula de RNA que é complementar ao mRNA é denominada “RNA antissenso” ou “RNA com sentido inverso” (antisense RNA). A síntese de cadeias de RNA, assim como as de DNA, ocorre na orientação 5’ 3’, com a adição de ribonucleotídeos ao grupo 3’ OH na extremidade da cadeia. A reação involve um ataque nucleofílico pela 3’ OH no átomo de fósforo mais interior do ribonucleosídeo trifosfato com a eliminação de pirofosfato. Esta reação é catalizada por enzimas denominadas RNA polimerases (RNAPs). A reação geral é: n: número de mols RTP: ribonucleotídeos trifosfato RMP: ribonucleotídeos monofosfato PP: pirofosfato As RNA polimerases se ligam a sequências específicas no DNA denominadas promotores e, com o auxílio de certas proteínas designadas fatores de transcrição,iniciam a síntese de moléculas de RNA em sítios próximos ao promotor. A síntese de RNA ocorre em um segmento de DNA localmente aberto gerado pela RNA polimerase e algumas vezes chamado bolha de transcrição. As características básicas da transcrição são as mesmas em procariotos e eucariotos, mas muitos detalhes - como as sequências do promotores - são diferentes. A RNAP de procariotos sintetiza todas as espécies de RNA (mRNA, tRNA, e rRNA). Um segmento de DNA que é transcrito é chamado de unidade de transcrição. Unidades de transcrição podem ser equivalentes a genes, ou podem incluir vários genes. Transcritos que contém várias sequências funcionais (RNAs ou proteínas) são denominados policistrônicos - vários cistrons ( genes) e são comuns em bactérias. O processo de transcrição pode ser dividido em três etapas: - Iniciação de uma nova cadeia de RNA - Elongação da cadeia - Terminação da transcrição e liberação a molécula nascente de RNA Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce Marilena Realce No contexo de transcrição, os seguintes termos são utilizados: - upstream (= a montante: no sentido da nascente do rio) em direção à extremidade 5’ do transcrito - downstream (= a jusante: no sentido da foz) em direção à extremidade 3’ do transcrito Esta terminologia reflete o fato do RNA nascente ter sentido 5’ 3’ downstream a jusante, rio abaixo, direção a foz - 3’ upstream a montante, rio acima, direção a nascente - 5’ As RNAs polimerases que catalizam a transcrição são complexos proteicos multiméricos. O “complexo inteiro” (holoenzyme) da RNAP de E. coli possui um peso molecular de 480 KDa e consiste em 5 polipeptídeos: 2’. As subunidades estão envolvidas na formação do núcleo tetramérico 2’. A subunidade contem o sítio de ligação ao ribonucleosídeo trifosfato. A subunidade ’ hospeda a região de ligação ao DNA molde. A subunidade está envolvida apenas na iniciação da transcrição. Sua função é reconhecer e ligar a RNAP à sequência promotora no DNA. Após a iniciação da cadeia de RNA, o fator é liberado e a elongação é executada pelo complexo central (core enzime) 2’. A iniciação das cadeias de RNA envolvem três passos: - ligação da holoenzyme à região promotora do DNA - separação localizada das fitas de DNA pela RNAP, providenciando uma regiãoaberta (ssDNA) para o pareamento dos ribonucleotídeos que estão chegando - formação de ligações fosfodiésteres entre os primeiros ribonucleotídeos da cadeia nascente. A holoenzyme permanece ligada à região promotora durante a síntese das primeiras 8 ou 9 ligações fosfodiésteres, então o fator sigma é liberado e a core enzyme inicia a fase de elongação da síntese de RNA. Durante a iniciação, pequenas cadeias de 2 a 9 nucleotídeos são sintetizadas e liberadas. Esta síntese abortiva pára quando as cadeias de 10 ou mais nt forem sintetizadas e a RNAP começa a se mover a jusante (downstream). Por convenção, o primeiro nucleotídeos da cadeia nascente de RNA é designado +1. Nucleotídeos a jusante (downstream) são numerados em ordem crescente: +2, +3… Nucleotídeos a montante (upstream) são numerados de maneira negativa, pois estão localizandos na DIREÇÃO OPOSTA à transcrição: -1, -2, -3, -4…. +1 +2 +3 +4.... downstream upstream ... -4 -3 -2 -1 Como mencionado anteriormente, o fator sigma se liga aos promotores. Centenas de promotores de E. coli foram sequenciados e eles demonstram muito pouco em comum. Duas pequenas sequências dentro destes promotores são suficientemente conservadas para serem identificadas. Mas nem mesmo elas são totalmente idênticas entre diferentes promotores. Os pontos médios destas duas sequências ocorrem aproximadamente em -10 e -35. As sequências de nucleotídeos presentes nestes elementos genéticos altamente conservados são chamados sequências consenso. A sequência consenso -10 (na fita não-molde) é TATAAT (Pribnow-Schaller box), cuja constituição facilita a abertura do DNA, requisito essencial para a transcrição. A sequência consenso -35 (na fita não-molde) é TTGACA, também conhecida como sequência de reconhecimento, pois é onde o fator sigma se liga. Em >90% dos casos, o primeiro nt dos transcritos de E. coli é uma purina (G ou A). A elongação da cadeia é executada pela core enzyme da RNAP, após a liberação da subunidade sigma. A extensão da cadeia ocorre dentro da bolha de transcrição. A RNAP possui tanto a atividade de abertura (helicase) quando de fechamento da bolha, a qual vai se deslocando ao longo do DNA durante a transcrição. Em E. coli, o tamanho médio da bolha é de 18 pb e 40 nt são incorporados na cadeia crescente por segundo. A cadeia nascente é deslocada do DNA molde enquanto a RNAP se move, sendo que a região de pareamento transitório entre DNA/RNA é de provavelmente apenas 3 pb. A terminação das cadeias de RNA ocorre quando a RNAP encontra um sinal de terminação, liberando o transcrito. Há dois tipos de terminadores em E. coli: - Terminadores dependentes da proteína rho () - Terminadores independentes da proteína rho Terminadores independentes de rho contêm uma região rica em CG seguida por seis ou mais pares de base “AT” (“As” na fita molde). A sequência rica em “CG” cria uma estrutura no formato de grampo que retarda o movimento da RNAP, causando uma pausa. A sequência rica em “CG” cria uma estrutura no formato de grampo e retarda o movimento da RNAP, causando uma pausa. Neste momento o complexo fica fragilmente ligado apenas por uma região A:U. Imagina-se que isto facilite a liberação do transcrito recém sintetizado. Os detalhes do mecanismo de terminação dependente de rho ainda são incertos. Rho se liga à cadeia nascente de RNA e se move no sentido 5’ 3’ , parecendo perseguir a RNAP. Quando a RNAP encontra o sinal de terminação dependente de rho – uma sequência de 50 a 90 pb que especifica uma região rica em “Cs” (e sem “Gs”) – ela reduz a velocidade e pausa. Neste momento rho a alcança a RNAP e expulsa o transcrito nascente para fora da bolha de transcrição. Em procariotos a tradução e degradação de um mRNA frequentemente começam antes do término de sua síntese. Uma vez que o RNA é sintetizado, traduzido e degradado no sentido 5’3’, todos os três processos podem ocorrem simultaneamente na mesma molécula de RNA. Uma vez que os procariotos não possuem um envelope nuclear separando o DNA dos ribossomos, transcrição e tradução ocorrem juntas.Portanto: - a fita molde de DNA é transcrita e gera o RNA senso. - A fita não-molde de DNA não é transcrita. - O RNA senso tem sequência idêntica à fita não-molde de DNA (T U) - As fitas de DNA e RNA que são complementares ao RNA senso são chamados respectivamente de “DNA complementar” e “RNA antissenso” molde não-molde RNA senso
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