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Prof. Dr. Rodrigo Elisandro Mendes
Pós-doutorando da Disciplina de Infectologia
Universidade Federal de São Paulo - EPM
Métodos Fenotípicos para Detecção dos Mecanismos de Resistência Antimicrobiana em Bacilos Gram-Negativos
Índice
Principais Problemas
Parede celular bacteriana
Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
Principais Problemas em Enterobactérias
Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores
-lactamases Localização dos genes bla
Detecção de -lactamases
-lactamases de espectro ampliado
ESBL no Brasil
Infecções por amostras produtoras de ESBL SURTO
Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL
-lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Resistência aos carbapenens Enterobactérias
Detecção de Metalo- -lactamases 
Detecção de amostras produtoras de MBL 
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant 
Metalo--lactamases emEnterobactérias no Brasil
Principais Problemas
Enterobactérias
Resistência às cefalosporinas de amplo espectro
Resistência aos carbapenens (rara)
Bacilos Gram-negativos não fermentadores
Resistência aos carbapenens
Resistência às polimixinas (rara)
Parede celular bacteriana
Bactéria Gram-positiva
Bactéria Gram-negativa
Pelcza, Microbiology, 1999.
Bactéria Gram-positiva
Bactéria Gram-negativa
Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
Principais Problemas em Enterobactérias
Resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos
	
Produção de -lactamases de espectro ampliado (ESBL)
Produção de -lactamases AmpC
Resistência aos carbapenens (rara)
	
Falsa resistência
Produção de ESBL/AmpC + alt. da membrana externa
Produção de Metalo- -lactamases (MBL)
Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores
Resistência aos carbapenens
		
Produção de AmpC + alt. da membrana externa
Produção de Metalo- -lactamases (MBL)
Efluxo ativo
Resistência às polimixinas (rara)
		
Alteração da composição lípidica do LPS e/ou 
Hiperexpressão da porina OmprH 
-lactamases
São enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico
Principal mecanismo de resistência entre gram-negativos
Grande diversidade 
Produção mediada pelo DNA cromossômico ou extra-cromossômico (plasmídios e transposons)
Localização dos genes bla
Conjugação entre bactérias da mesma espécie
Conjugação entre bactérias de espécies diferentes
Transmissão e disseminação
DNA Cromossomal
DNA 
Extra-Cromossomal
Divisão binária
Cél. Mãe para cél. filha
Disco de Nitrocefin
Detecção de -lactamases
+
-
+
-
-lactamases de espectro ampliado
(extended-spectrum beta-lactamase)
Enterobactérias: E. coli e K. pneumoniae 
Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis
Vários genes: tem, shv, per, ges, ctx, oxa 
Degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e das cefamicinas
Geralmente, inibidas pelos inibidores de -lactamases (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)
Bush et al., AAC 39:1211, 1995
-lactamases de espectro ampliado
(extended-spectrum beta-lactamase)
-lactamases de espectro ampliado
 Importância Clínica
Posso utilizar cefalosporinas de amplo espectro para o tratamento de Infecções causadas por bactérias produtoras de ESBL?
-lactamases de espectro ampliado
 Importância Clínica
Paterson et al., J Clin Microbiol 39:2206, 2001.
MIC (
µg
/ml)
 
Fal
ência terapêutica
 
% (N) 
 
Morte até 14 dias 
após bacteremia
N(%)
 
8
 
100 (6/6)
 
33 (2/6)
 
4
 
67 (2/3)
 
0 (0/3)
 
2
 
33 (1/3)
 
0 (0/3)
 
£
1 
 
27 (3/11)
 
18 (2/11)
 
Total
 
54 (15/28)
 
 
CTX-M-8 - Rio de Janeiro - C. amalonaticus e E. cloacae 	Bonnet et al., J Clin Microbiol 44:1936, 2000.
BES-1 - Rio de Janeiro - Serratia marcescens 
	Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother 44:3061, 2000.
CTX-9 e -16 - Rio de Janeiro - E. coli e E. cloacae 
	Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother. 45:2269, 2001.
SHV-27 - Aracajú - Klebsiella pneumoniae
	Corkill et al., J Antimicrob Chemother 47:463, 2001. 
CTX-M - São Paulo - Klebsiella pneumoniae 
	Carmo Filho. Doutorado UNIFESP/EPM, 2003.
ESBL no Brasil
Infecções por amostras produtoras de ESBL
SURTO
l
1 2 
l
3 4 5 
l
6 7
Amostras de 
P. mirabilis
produtoras de ESBL isoladas pelo 
Programa SENTRY 1997
-
1998
Todos os métodos fenotípicos se baseiam na inibição da atividade da enzima pelos inibidores de -lactamases (IBL)
 Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
 Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS)
 Teste de Adição de IBL aos discos de cefalosp.
 Discos combinados
 Teste de dupla-difusão em disco 
 Etest
 Métodos automatizados
 Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Limites de Triagem do CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis*
CLSI, 2005
Disco Difusão
 
MIC
 
Aztreonam
<
 27 mm
 
>
2 
µ
g/mL
Ceftazidima*
<
 22 mm
 
>
2 
µ
g/mL
Ceftriaxona
<
 25 mm
 
>
2 
µ
g/mL
Cefotaxima*
<
 27 mm
 
>
2 
µ
g/mL
Cefpodoxima*
 
<
 17 mm
 
>
2
*
/
>
8
 
µ
g/mL
 
 
 
Disco difusão 
Meio de Müller-Hinton
Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados ao ácido clavulânico
	
POSITIVO
Aumento do halo  5 mm da associação 
CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX 
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis
Disco difusão 
Ácido Clavulânico
Preparar solução estoque 1000 l fresca ou congelada a –70°C
Adicionar 10 l desta solução sobre os discos de CAZ e CTX uma hora antes do teste
Controle de Qualidade
- Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603
- Negativo: E. coli ATCC 25922
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI
Teste de adição de IBL
Jacoby & Han, 1996 
Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000. 
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste de adição de IBL
Métodos dilucionais
Meio de Müller-Hinton com a concentração de cátions ajustada
Concentrações dos antimicrobianos:
ceftazidima: 0.25-128 g/ml
ceftazidima/ácido clav.: 0.25/4-128/4g/ml E
cefotaxima: 0.25-64 g/ml
cefotaxima/ácido clav.: 0.25/4-128/4g/ml
	
POSITIVO
Redução  3.0 diluições
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis
CLSI, 2005
Métodos dilucionais 
Controle de Qualidade
Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603
Negativo: E. coli ATCC 25922
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI
Teste de adição de IBL
CLSI, 2005
Vantagens
Teste simples;
Fácil interpretação;
Custo
Limitações
Preparo e armazenamento da solução estoque de ácido clavulânico;
Caracterização errônea
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Teste de adição de IBL
1
2
3
4
5
6
1.Cefpodoxima, 
2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,
3. Ceftazidima, 
4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 
5. Cefotaxima 
6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
1
2
3
4
5
6
1. Cefpodoxima, 	2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,
3. Ceftazidima, 	4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 
5. Cefotaxima 	6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico
Vantagens
Teste simples;
Fácil interpretação;
Custo
Limitações
Substrato (novo disco com cefpiroma);
Não detecção de amostras produtoras de SHV-6
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
Sensibilidade
Ceftazidima = 86% 	Cefotaxima
= 65.5%
Combinados = 93%
100% das amostras produtoras de ESBL apresentaram aumento no halo > 5 mm, enquanto as produtoras de AmpC e K1 apresentaram aumento < 1 mm.
M'Zali et al. J Antimicrob Chemother45:881-5 , 2000. 
Carter et al. J Clin Microbiol 38:4228-32, 2000.
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
De Gheldre et al. J Antimicrob Chemother. 52:591-7, 2003
Sensibilidade/Especificidade (%)
Escherichia coli e Klebsiella spp.
CAZ/clav: 88% e 92%
CTX/clav: 90% e 92%
CPR/clav: 95% e 84%
CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 82% 
Enterobacter aerogenes
CAZ/clav: 94% e 100%
CTX/clav: 94% e 100%
CPR/clav: 94% e 100%
CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 100%
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
Pereira et al. J Bras Patol Med Lab 39:301-308, 2003. 
134 amostras de K. pneumoniae do Hospital Säo Paulo – 1996/2001
Discos da Oxoid
Cefotaxima e cefpodoxima: S e E = 100% 
Etest ESBL
S = 96% e E = 100%
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados
Jarlier, 1988
 Distância de 30 mm
CAZ
ATM
CRO/
CTX
CPM
AMX/AC
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação
Jarlier, 1988
Teste Positivo
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação
Teste Positivo
Vantagens
Teste simples;
Não necessita de reagentes especiais
Limitações
Distância entre os discos;
Armazenamento dos discos com ácido clavulânico;
Interpretação
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação
Fitas disponíveis
Ceftazidima, cefotaxima e cefepima
Critério de positividade 
Redução  3.0 diluições 
Razão TZ/TZL > 8
Razão CT/CTL > 8
TZ = 32
TZL =2
32  16  8  4  2
Cormican & Jones, 1996
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest®
Cormican & Jones, 1996
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest®
Cormican & Jones, 1996
Zona Fantasma
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest®
Zona Fantasma
Vantagens
Teste simples;
Limitações
Substrato específico;
Não detecção de amostras, cuja as MICs situem acima das diluições testadas;
Custo
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest®
MicroScan – Painéis de Gram-negativos
Triagem para ESßL
Poços que contêm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL associados ao clavulanato
ESßL plus Confirmation Panel
Antimicrobiano (conecntação testada em g/ml)
Aztreonam		0.5 – 64	Cefpodoxima		0.5 – 64	
Cefepima		1 – 32		Ceftazidima		0.5 – 128	
Cefoxitina		2 – 32		Ceftazidima/Clav4	0.12/4 – 16/4	
Cefotaxima		0.5 – 128	Ceftriaxona		1 – 64	
Cefotaxima/Clav4	0.12/4 – 16/4	Meropenem		0.5 – 16	
Cefotetan		1 – 32		Piperacillina		16 – 64	
		 	Imipenem		0.5 – 16
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados
Vitek – Painéis de Gram-negativos
 Triagem para ESßL
Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 g/mL associados ao clavulanato
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados
Vantagens
Padronização intra- e inter-laboratorial; 
Limitações
Substrato específico;
Não detecção de amostras, cuja as MICs situem acima das diluições testadas;
Custo
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Métodos Automatizados
CLSI, 2005
Detecção de amostras produtoras de ESBL
K. pneumoniae ATCC 700603 – CQ ESBL +
Avaliação da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL
		Reis et al., J Bras Patol Clin 37:43, 2001. 
Teste
 
Sens.
 
Espec.
Disco difusão (bkpts ESBL
-
NCCLS)
 
89
 
62
 
Dupla Difusão
 
41
 
100
 
ESBL Etest®
 
89
 
98
 
Disco difusão (CTX + AZT 
-
 NCCLS)
 
88
 
83
 
Adição de clavulanato
 
97
 
47
 
MICs para 5 substratos (Etest)
 
100
 
100
 
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Sugestão
Limites de triagem estabelecidos pelo CLSI;		+
Teste de dupla-difusão em disco, ou
Discos combinados 
-lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Livermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991
Antimicrobianos hidrolisados: aztreonam, cefalosporinas de amplo espectro e penicilinas de amplo espectro 
Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa - cromossomal
Não são inibidas por inibidores de β-lactamases
Produzidas em pequena quantidade a menos que sejam induzidas
Agente retirado  produção volta a níveis basais ou pode ocorrer mutação e desrepressão
CAZ
CFO
CRO
D
Distância em mm = raio do beta-lactâmico - 3 
			 2
-lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Teste de indução de -lactamases AmpC
Resistência aos carbapenens
Enterobactérias
Checar resultados das cepas ATCCs
Verificar a validade e a estocagem dos discos;
				
Verificar a identificação; 
Repetir o teste de sensibilidade  técnica  
Confirmada  Lab. de referência
Resistência aos carbapenens
Metalo--lactamases
Hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenens
Genes cromossômicos e plasmidiais (transposons, integrons)
Zn++ como cofatores enzimáticos 
Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol
Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil)
Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA) 
GIM-1 (Alemanha)
SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)
(Page 2002, Rossolini et al 2001; Nordmann & Poirel 2002, Toleman et al 2002)
Detecção de Metalo- -lactamases 
Importância Clínica
A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas

Medidas de Controle 
Detecção do mecanismos – opções terapêuticas – Novas drogas como IMBL.
Detecção de amostras produtoras de MBL 
Disco- aproximação IMBL
 Distância de 15-25 mm
CAZ
IMP
IMBL
Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.
 Distância de 4-5 cm
IMBL
EDTA – 5 l 100 mM
2-MPCA puro – 2 a 3 l 
Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico
NEGATIVA
POSITIVA
Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.
Detecção de amostras produtoras de 
Metalo--lactamases
IMP
IMP/EDTA
Critério de 
positividade: 5 mm? 
Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Adição de EDTA 
Detecção de amostras produtoras de 
Metalo- -lactamases - Etest
 
Walsh et al., J Clin Microbiol 40:2755-9, 2002.
Critério de positividade : 	Redução  3.0 diluições 
Controles de Qualidade
CQ -: P. aeruginosa ATCC 27853
CQ +: P. aeruginosa 48-1997A (produtora de SPM)
 P. putida 48 – 1234 (produtora de IMP -1) 
Detecção de amostras produtoras de 
Metalo- -lactamases
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--Lactamase in Distinct Brazilian Regions
Gales et al. J Antimicrob Chemother 52:699, 2003. 
Metalo--lactamases em 
Enterobactérias no Brasil
First Isolation of a Metallo--lactamase-Producing-multiresistant Klebsiella pneumoniae from a Patient in Brazil 
			Lincopan et al. J Clin Microbiol 43:516, 2005. 
Outbreak caused by a Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Producer of IMP-1 Metallo--Lactamase in a Brazilian Teaching Hospital
			Grimbaun et al. 44th ICAAC, Washington, DC. 2004.