AULA 3 - DNA recombinante, clonagem e Enzimas de Restrição pdf

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DNA recombinante, Clonagem e 
Enzimas de Restrição
DNA 
Recombinante
O que é?
• Moléculas de DNA que possuem fragmentos 
de DNA derivados de duas ou mais fontes, 
geralmente de espécies diferentes.
• A clonagem molecular é a técnica central 
que possibilita a produção de DNA 
recombinante, a partir da transferência de 
um gene de um organismo para outro, ou 
seja, a recombinação de DNA proveniente de 
diferentes fontes.
1. Plasmídeo é um DNA circular 
bacteriano de replicação 
independente.
2. Uma bactéria pode conter vários 
plasmídeos que geralmente tem gene 
de resistência à antibióticos. 
3. Muito utilizados em técnicas de 
clonagem molecular, para inserção 
de genes de interesse.
Clonagem 
Molecular
• Processo que permite fazer cópias 
idênticas de um pedaço específico de 
DNA. 
• Um gene (ex: gene para uma proteína humana de 
interesse médico) é inserido em DNA 
plasmidial ou plasmídeo. 
• Tal inserção possibilita a produção de 
uma molécula de DNA recombinante 
(plasmídeo recombinante), ou seja, DNA 
montado a partir de fragmentos de 
várias fontes.
Clonagem
Molecular
• O DNA recombinante é introduzido em bactérias, que 
são selecionadas e cultivadas. 
• Conforme se reproduzem, replicam o plasmídeo e o 
transmitem para seus descendentes, produzindo
cópias do DNA recombinante.
Etapas da 
Clonagem
Molecular
1) Isolamento do gene de interesse
• Realizado com enzimas de restrição, que 
reconhecem uma sequência alvo específica e 
cortam seletivamente o fragmento que será 
utilizado.
Etapas da 
Clonagem Molecular
• Cortar e abrir o plasmídeo 
(vetor) e inserir o gene de 
interesse (inserto), para 
formar o DNA recombinante. 
• As enzimas de restrição 
cortam o DNA e a DNA ligase
une/cola o DNA.
2) Inserção
Etapas da 
Clonagem 
Molecular
2) Inserção
Enzimas de 
Restrição
• São enzimas que reconhecem uma
sequência alvo específica e cortam o 
DNA em dois pedaços (tesouras
moleculares).
• Reconhecem uma sequencia específica
de nucleotídeos, chamada de sítio de 
corte ou sítio de restrição, e apenas
moléculas que apresentem essa
sequencia serão cortadas.
• Nome tem origem a partir do 
organismo do qual foi isolada: 
Ex: EcoRI - Escherichia coli, R – genótipo RY13, I –
ordem de identificação
As enzimas de restricao sãoAs enzimas de restricao são
encontradas em bactérias e as 
protegem da infeccão por vírus
por meio do corte das moléculas
de DNA destes, impedindo a sua
replicacao.
Enzimas de Restrição
Corte Assimétrico/ Coesivo Corte Simétrico/ Cego
DNA ligase
• As enzimas DNA ligase unem
fragmentos de DNA com terminações
complementares, formando uma
molécula intacta.
• Para unir os fragmentos através da 
ligação fosfodiéster, haverá gasto de ATP. 
Citosol
AG
Ok, pro! 
Entendi 
tudinho!
• O DNA recombinante 
(plasmídeo) é transportado para 
dentro da bactéria, através do 
processo de transformação. 
• Esta célula transformada sofrerá 
muitas divisões, produzindo 
várias cópias do DNA 
recombinante (plasmídeo).
Etapas da 
Clonagem Molecular
3) Transformação
3) Transformação
Etapas da 
Clonagem Molecular
• O processo ocorre por choque 
térmico ou eletroporação
(ondas eletromagnéticas a partir de 
correntes elétricas de alta voltagem e 
curtos pulsos). 
• Estas técnicas abrem “poros” 
nas bactérias permitindo a 
entrada do novo DNA 
(plasmídeo). 
• Plasmídeos possuem gene 
de resistência, permitindo a 
sobrevivência da bactéria na
presença de um antibiótico. 
• Bactérias com o plasmídeo
(DNA recombinante), serão
capazes de sobreviver e se 
reproduzir na presença de 
antibióticos. 
• Bactérias sem o plasmídeo
morrerão. 
Etapas da 
Clonagem Molecular
4) Seleção
Aplicação da técnica
Biofármacos
• Síntese de proteínas humanas com 
aplicações biomédicas. 
Ex: As bactérias servem como mini 
"fábricas," produzindo grandes
quantidades de proteína, pois o seu
plasmídeo contém o gene da insulina
humana e por isso realizam a transcrição e 
tradução do RNAm, produzindo muitas
moléculas de insulina. 
Aplicação da técnica
Biofármacos
Aplicação da técnica
Terapia genética
Alguns pacientes não possuem genes 
funcionais, e este tipo de terapia tenta
fornecer uma cópia normal do gene para 
as células do paciente. 
Ex: Clonagem molecular para construir uma
versão normal do gene que causa fibrose
cística, auxiliando na melhora da função
pulmonar destes pacientes. 
Aplicação da técnica
Análise genética
Em laboratórios de pesquisa básica , 
os biólogos geralmente usam a 
clonagem de DNA para construir
versões artificiais, recombinantes dos 
genes que os ajudam a compreender
como é a função normal dos genes 
num organismo
Aplicação da técnica
Transgênicos
O organismo
transgênico é 
permanentemente
alterado
geneticamente
através de tecnologia
do DNA 
recombinante. 
Aplicação da técnica
Produção de vacinas
Vacinas de RNAm.
Ex: Vacina contra a Covid- 19 –
a sequência que codifica a proteína
Spike (importante para a sobrevivência
viral) passa pelo processo de clonagem
molecular. Posteriormente será retirada do 
plasmídeo e servirá de molde para síntese
de RNAm in vitro. Esse RNAm é 
o princípio ativo das vacinas e será envolto
em lipídeos para facilitar sua entrada nas
células de pessoas vacinadas, que 
irão produzir a proteína Spike que servirá
como antígeno e irá induzir a 
resposta imune.
Video
https://pt.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/v/dna-cloning-and-recombinant-dna
Referências Bibliográficas:
• ALBERTS, Bruces, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, 
Peter, RAFF, Martin. (04/2011). Biologia Molecular da Célula. 5ª edição. Porto 
Alegre: Artmed.
• ALBERTS, Bruce, BRAY, Dennis, HOPKIN, Karen, JOHNSON, Alexander, LEWIS, 
Julian, RAFF, Martin, ROBERT. (01/2015). Fundamentos da Biologia Celular. 3ª 
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• LIPAY, Monica V. N; BIANCO, Bianca; Biologia molecular - métodos e interpretação 
1. ed. - Rio de Janeiro: Roca, 2015.
• LODISH, H.; BERK, A.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.; SCOTT, M.P.; 
ZIPURSKY; DARNELL. Biologia Celular e Molecular. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed, 
2005. 1054p.
• BRUNO, A. N. (Org.). Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Porto Alegre: 
Artmed, 2017.
1) O que é um DNA recombinante?
2) O que é uma enzima de restrição e quais são os tipos de
cortes? Exemplifique
3) Quais são e o que ocorre nas etapas da clonagem
molecular?
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