replicação (2)

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Replicação do DNA
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Mitose / Meiose
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Como acontece a síntese do DNA?
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Meselson-Stahl experiment
1957
Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14
Purificação do DNA das bactérias
Três tipos de DNA
N-15 + N-15
N-15 + N-14
N-14 + N-14
Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14
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Replicação semi-conservativa
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Origens de replicação
Locais com um contexto de sequência específico
Ligam proteínas específicas
Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação
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Origens de replicação
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Replicação
DNA Polimerase III
Sentido 5’ → 3’
Nucleotídeos 3P são adicionados
Liberação de Pirofosfato
http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf 
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Primase
Ribonucleoproteína
Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo
Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH
DNA polimerase lenta e sujeita a erros
Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido
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Micrografia, bolha de replicação
Forquilhas de replicação
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Forquilha de replicação
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Replicação das fitas
Fita líder
Primase age uma vez
Fita retardada
Primase age várias vezes
1967, Fragmentos de Okasaki
 Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60
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Primase na fita retardada
Deslocamento da forquilha de replicação
Primase faz primer
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Direções de 
replicação na Forquilha
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Desenovelamento do DNA
Retirada das histonas
Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)
DNA helicase
Quebra pontes de H
DNA topoisomerases
Tiram a tensão
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Forquilha de replicação
Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua)
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DNA polimerase
Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA
Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre
Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre)
Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’)
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Tipos de DNA polimerase
DNA polimerase I
Descoberta em 1956 (Kornberg pai)
Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita descontínua
DNA polimerase III
Descoberta em 1970 (Kornberg filho)
Principal enzima que realiza a replicação em procariotos
DNA polimerase II
Lenta, envolvida em reparo do DNA
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DNA Replication
DNA Pol precisa de um molde inicial
Primase: gera um molde de RNA complementar
A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH
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Eliminação dos fragmentos de Okasaki
DNA Pol I
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Mecanismo da enzima Ligase
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Visão geral
Repare na posição do primer de RNA
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Reparo pela Polimerase
Mecanismo de verificação (Proof-reading)
DNA-polimerase possui
Uma atividade de polimerização 5’→ 3’
Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’
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Reparo pela Polimerase
Mecanismo de verificação (Proof-reading)
DNA-polimerase possui
Uma atividade de polimerização 5’→ 3’
Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’
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DNA Repair
Checagem de pareamento incorreto (eucariotos)
Proteínas especiais para reparo do erro
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E as extremidades dos cromossomos?
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Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação
Ataxia de Friedreich's
dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração)
forma mais comum das ataxias herdadas
A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença.
Xeroderma pigmentosum 
envelhecimento precoce 
aumento na incidência de câncer
Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV
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Ciclo celular
A replicação do DNA é regulada temporalmente
Fase S do ciclo celular
Checkpoints do ciclo celular
Ciclinas
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Conclusões
Replicação semi-conservativa
Bolha de replicação avança em duas direções
Fita líder e fita retardada
Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA
Primase faz o primer
DNA polimerase III, DNA polimerase I
DNA ligase
Telomerase
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