Aula 14 - Métodos de Isolamento e Cultivo de Fungo (aula_14_metodos_de_isolamento_e_cultivo_de_fungos.pdf)

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Métodos de Isolamento e Cultivo 
de Fungos 
Prof.: Daniela Pontes 
Roteiro 
• Coleta da amostra 
• Fatores relacionados à contaminação de 
alimentos por fungos 
• Técnicas de isolamento e identificação de fungos 
relacionados a contaminantes de alimentos 
• Microscopia do material 
• Semeadura do material 
COLETA 
Colheita da Amostra 
• Utilizar utensílios esterilizados. 
• Material clínico: 
- Somente após suspensão de medicação antifúngica: 15 dias (uso 
tópico), 30 dias (uso sistêmico). 
- Informações sobre o paciente acompanhando a amostra. 
• Alimentos: 
- Produtos prontos para consumo devem ser coletados em suas 
embalagens originais fechadas. 
- Embalagens abertas: devem ser acondicionadas adequadamente 
para evitar contaminação com outros alimentos, com 
manipuladores, com o ambiente, etc. 
 
FATORES RELACIONADOS À CONTAMINAÇÃO DE 
ALIMENTOS POR FUNGOS 
A capacidade de sobrevivência ou de multiplicação dos 
microrganismos que estão presentes em um alimento depende 
de uma série de fatores: 
 
• Fatores Intrínsecos 
 
• Fatores Extrínsecos 
Relacionados com as 
características próprias do alimento 
Relacionados com o ambiente em 
que o alimento se encontra 
Permite prever, em determinado alimento, a "vida de prateleira", a 
estabilidade microbiológica, a capacidade de crescimento e/ou produção 
de toxinas por microrganismos patogênicos eventualmente presentes. 
Fatores Intrínsecos 
• Atividade de água (Aa) 
• Acidez (pH) 
• Potencial de oxi-redução (Eh) 
• Composição química 
• Presença de fatores antimicrobianos naturais 
• Interações entre os microrganismos presentes nos alimentos 
Fatores Intrínsecos 
Atividade de água (Aa): 
• Parâmetro que mede a disponibilidade de água em um 
alimento. 
• Água disponível: água que não está ligada a macromoléculas 
por forças físicas; do contrário, não está livre para agir como 
solvente ou para participar de reações químicas. 
Fatores Intrínsecos 
Acidez (pH): 
• pH em torno da neutralidade (entre 6,5 e 7,5) é o mais 
favorável para a maioria dos microrganismos. 
• Os bolores e leveduras mostram maior tolerância ao pH. 
• Bolores podem multiplicar-se em valores de pH mais baixos 
que as leveduras. 
• Frutas, refrigerantes, vinhos, e vinagres normalmente 
deterioram-se devido ao crescimento de bolores e leveduras, 
que toleram pH inferior a 3,5. 
Faixa aproximada de pH de crescimento de alguns 
microrganismos encontrados em alimentos. 
Fatores Intrínsecos 
Potencial de Oxi-redução (Eh): 
• Definido como a facilidade com que determinado substrato 
ganha ou perde elétrons. 
• Quanto mais oxidado (perdeu elétrons) é um composto, 
mais positivo é o seu Eh. 
• Quanto mais reduzido (ganhou elétrons) é um composto, 
mais negativo é o seu Eh. 
• Microrganismos aeróbios (bolores e leveduras aeróbias) 
requerem valores de Eh positivos para multiplicação. 
Fatores Intrínsecos 
Composição química: 
• Água 
• Fonte de energia: açúcares, lipídios. 
• Fonte de nitrogênio: aminoácidos, nucleotídios, peptídios, 
proteínas. 
• Vitaminas: complexo B, biotina, ácido pantotênico. 
• Sais minerais: Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Mo, Zn, Co, P, S. 
Fatores Intrínsecos 
Presença de fatores antimicrobianos naturais: 
• Presentes naturalmente em alguns alimentos, com 
capacidade de retardar ou impedir a multiplicação 
microbiana. 
• Exemplos: óleos essenciais com atividade antimicrobiana 
presentes em condimentos; derivados do ácido 
hidroxicinâmico, tanino, ácidos orgânicos e óleos essenciais, 
encontrados em frutas e vegetais. 
• Estruturas biológicas que funcionam como barreiras 
mecânicas para penetração do microrganismo: cascas, peles 
dos animais, película das sementes. 
Fatores Intrínsecos 
Interações entre os microrganismos presentes nos alimentos: 
• Determinado microrganismo, ao se multiplicar em um 
alimento, produz metabólitos que podem afetar a 
capacidade de sobrevivência e de multiplicação de outros 
microrganismos presentes nesse alimento. 
Fatores Extrínsecos 
• Umidade ambiental 
• Temperatura ambiental 
• Composição química da atmosfera que envolve o alimento 
 
Fatores Extrínsecos 
Temperatura ambiental: 
•Fungos podem crescer em faixas de temperatura mais ampla 
do que as bactérias. 
•Muitos fungos são capazes de se multiplicar em alimentos 
refrigerados. 
•As leveduras não toleram bem temperaturas altas, preferindo 
as faixas mesófila e psicrófila. 
 psicrófilos: crescem a T de 0 a 20°C 
• mesófilos: crescem a T de 20 a 40°C 
 termófilos: crescem a T de 40 a 50°C 
Fatores Extrínsecos 
Composição química da atmosfera que envolve o alimento: 
• A composição gasosa do ambiente que envolve um alimento 
pode determinar os tipos de microrganismos que poderão 
nele predominar. 
• A presença de oxigênio favorecerá a multiplicação de 
microrganismos aeróbios e sua ausência causará 
predominância dos anaeróbios. 
TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE 
FUNGOS RELACIONADOS A CONTAMINANTES DE 
ALIMENTOS 
Análise dos Alimentos 
Objetivos: 
• Conhecer as condições de higiene em que o alimento foi 
preparado; 
• Conhecer os riscos que o alimento pode oferecer à saúde do 
consumidor; 
• Conhecer se o alimento terá ou não a vida útil pretendida; 
• Determinar o agente etiológico mais provável no caso de um 
episódio de toxinfecção alimentar; 
• Verificar se os padrões e especificações microbiológicos, 
nacionais e internacionais, estão sendo atendidos 
adequadamente. 
Análise dos Alimentos 
Amostragem: 
• Produtos prontos para consumo devem ser coletados em 
suas embalagens originais fechadas, com especificações de 
identificação: número do lote, data de fabricação, etc. 
• Embalagens abertas: devem ser acondicionadas 
adequadamente para evitar contaminação com outros 
alimentos, com manipuladores, com o ambiente, etc. 
• Utilizar utensílios esterilizados. 
Análise dos Alimentos 
Amostragem: 
• Amostras de alimentos perecíveis refrigerados: mantidas 
entre 0 e 4,4°C até o início da análise. 
• Alimentos congelados: descongelar somente para realização 
da análise. 
• Toda amostra deve ser analisada até 36h após sua obtenção, 
do contrário deve ser refrigerada ou congelada, dependendo 
do tipo de produto, objetivo da análise e tipo de 
microrganismo a ser pesquisado. 
Análise dos Alimentos 
Preparação da amostra para análise: 
• Técnicas assépticas em todas as etapas. 
• Uma homogeneização de toda a amostra é indispensável, pois a 
distribuição dos microrganismos nos alimentos não é uniforme. 
• Porção da amostra: 25g, 50g ou 100g (ou mL) 
• Para produtos sólidos ou semi-sólidos é necessária a 
homogeneização com diluente apropriado: diluente de Butterfield 
(água fosfatada tamponada, pH 7,2) ou água peptonada a 0,1%. 
• Alimentos ricos em gordura: emulsificação com agentes 
tensoativos. 
MICROSCOPIA DO MATERIAL 
(Exame Direto) 
Exame Direto 
• Preparações montadas entre lâmina e lamínula, imersas em 
uma substância que facilite a visualização microscópica 
(KOH, tinta da China, K-tinta). 
• Indica, na maioria das vezes, se o material examinado 
contém ou não estruturas fúngicas. 
• Preparados imediatos utilizados como auxiliares no 
diagnóstico clínico. 
Confecção de lâmina-lamínula com K-tinta. 
Fluxograma mostrando as principais técnicas utilizadas para 
confecção de lâminas do material clínico. 
KOH a 10-40% 
Prata-metenamina 
(corante) 
PAS, Grocott-
Gomori ou HE 
KOH a 10-40% 
SEMEADURA DO MATERIAL 
(Cultura) 
Cultura 
• Absolutamente necessária para o isolamento e identificação 
dos fungos. 
• Exame direto ou microscopiacom coloração -> semeadura 
em diversos meios de isolamento. 
• A escolha dos meios é orientada pelos achados micológicos 
do exame direto ou das preparações coradas e também pela 
suspeita clínica. 
• Meios de cultura primários: 
- Sabouraud simples 
- Sabouraud + cloranfenicol 
- Sabouraud + cloranfenicol + cicloeximida 
antibiótico 
inibe crescimento de 
fungos oportunistas 
Cultura 
Fluxograma mostrando os meios primários que devem ser utilizados para cada espécime 
clínico, bem como os intervalos de tempo sugeridos para observação do crescimento 
fúngico. 
fâneros = cabelos, 
pelos e unhas. 
Cultura 
• Meios de cultura diferenciais: 
- CHROMagar: usado para facilitar evidenciação de infecção mista 
por leveduras (quando a pesquisa direta indica possível existência 
de leveduras). 
- Sabouraud + BHI (Brain Heart Infusion) -> SABHI: para suspeita 
clínica de histoplasmose e/ou coccidioidomicose. 
CHROMagar com três tipos diferentes de 
colônias formadas. A – C. albicans; B – C. 
tropicalis; C – outras espécies. 
Placa de CHROagar: A - C. albicans, 
B - C. tropicalis, C - C. glabrata. 
Cultura 
Caracterização das Colônias: 
• Geralmente apresentam morfologias típicas, quando os 
microrganismos são semeados em meios com a mesma 
composição química. 
• Através do aspectos macroestruturais, é possível sugerir a 
espécie microbiana presente na colônia. 
• Na observação das características deve-se ressaltar os 
seguintes aspectos: 
- Tamanho da colônia, 
- Características dos bordos, 
- Textura, 
- Relevo, 
- Pigmentação. 
 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Tamanho: 
• A colônia pode apresentar-se com tamanho bastante 
variável, dependendo da qualidade e quantidade do 
substrato ofertado; 
• Colônias de uma mesma espécie fúngica, após semeadas e 
crescidas isoladamente em placa de Petri, se apresentam 
como macrocolônias. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Bordos: 
• Podem ser observados muitos desenhos, desde morfologias 
bem delimitadas até achados de projeções irregulares (que 
lembram franjas); 
• Podem ser observada, nos bordos das colônias, uma 
variação da coloração em relação ao centro → peça-chave 
para identificar o possível patógeno implicado. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Tamanho e bordos: 
Aspecto macroscópico de uma macrocolônia. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Textura: 
• colônias algodonosas: apresentam-se macroscopicamente com 
aspecto de algodão; 
• colônias furfuráceas: lembram um punhado de substância 
farinácea espalhado em uma superfície; 
• colônias penugentas: evidenciam-se estruturas que lembram 
pequenos fragmentos de penugem de aves; 
• colônias arenosas: assemelham-se a areia de praia; 
• colônias veludosas: apresentam aspecto de tecido aveludado; 
• colônias glabrosas: apresentam aspecto visual de cera ou 
manteiga. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Textura: 
Aspecto das colônias fúngicas quanto à textura: 1- colônias algodonosas; 2- 
colônias furfuráceas; 3- colônias penugentas; 4- colônias arenosas; 5- colônias 
veludosas; 6- colônias glabrosas. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Relevo: 
• colônias cerebriformes: topografia de altos e baixos, fazendo 
circunvoluções e lembrando o aspecto encontrado no cérebro; 
• colônias rugosas: variação da cerebriforme, só que as pregas 
topográficas se fazem menos evidentes e, às vezes, radiais, a 
partir do centro da colônia; 
• colônias apiculadas: presença de uma saliência na parte central, 
lembrando um pequeno cume; 
• colônias crateriformes: aprofundam no meio, assumindo o 
aspecto de uma cratera. 
 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Relevo: 
Aspecto das colônias fúngicas quanto ao relevo: 1- colônias cerebriformes; 2- 
colônias rugosas; 3- colônias apiculadas; 4- colônias crateriformes. 
Cultura 
Caracterização das Colônias – Pigmentação: 
Características dos fungos quanto à pigmentação: A- pigmento no verso da 
colônia; B- pigmento no reverso da colônia; C- pigmento difusível no meio de 
cultura. 
Cultura 
Achados Micromorfológicos: estruturas de frutificação e de 
ornamentação. 
Sequenciamento de figuras mostrando a preparação de microcultivo em lâminas 
para fungos filamentosos e dimórficos: A- placa montada e esterilizada; B- placa 
com meio para micromorfologia; C- montagem da lâmina; D- semeadura; E- 
crescimento; F- confecção de lâminas para microscopia. 
Cultura 
Provas Nutricionais: 
Provas nutricionais nos meios 
Trichophyton (7 meios), para auxiliar na 
identificação dos dermatófitos. 
Análise dos Alimentos 
Isolamento e Identificação de Fungos Relacionados a 
Contaminantes de Alimentos: 
• Métodos convencionais: testes bioquímicos 
• Métodos novos: 
- Técnicas bioquímicas miniaturizadas: kits 
- Técnicas imunológicas: ELISA e radioimunoensaio, para 
aflatoxinas. 
Bibliografia 
• SIDRIM, J. J. C. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da Micologia 
Médica. Editora Guanabara Koogan. 1999. 
 
• ALMEIDA, S. R. Micologia. Editora Guanabara Koogan. 2008. 
 
• FRANCO, B. D. G. M; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São 
Paulo: Editora Atheneu, 2008. 
 
• JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005.