Aula - Micobactérias (2ª prova)

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BIOSSEGURANÇA NOS Laboratórios de Micobacteriologia 
Introdução 
Equipamentos / Medidas de Segurança 
Câmara Biológica 
Lâmpada ultra-violeta 
Roupas, mascaras e luvas 
Centrífuga 
Pipetagem, esterilização 
Desinfetantes 
Baciloscopia 
Coloração de Ziehl - Neelsen
Introdução 
 * Principio 
* Preparação dos corantes 
* Técnica 
* Interpretação 
Baciloscopia não é para saber se é “micobactérias”. E sim p saber se é alcool ácido resistente. Corados pela fuscina e possuem Lipideos de parede q resistem a descoloração pelo alcool . Os bacilos que não são alcool resistentes tomam a cor do contra corante .
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1ª Etapa 
2ª Etapa 
3ª Etapa 
A tecnica de Ziehl requer o calor. 
1ª etapa, fixação do material (mais purulente, mais sanguinolento)
2ª fucsina fenicada, flamba para acelerar a reação
3 descarta o corante e coloca o alcool ácido
3
http://airblog-pg.blogspot.com.br/2010/03/o-bacilo-que-nao-desbota.html
BAAR (Bacilo Álcool –Ácido resistente)
Observar na objetiva de imersão
Critérios para a contagem de BAAR
Recomenda-se leitura de 100 campos
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Coloração fluorescente auramina O
Causas de erros nos exames microscópios 
Amostra insuficiente 
Má identificação 
Troca de lâminas/ escarros 
Esfregaços espessos ou delgados 
Laminas arranhadas 
Corantes precipitados 
Tecnica bem mais rápida, mas no Brasil quase não se usa. É mais caro. Contra coloração com per maganato de potassio. 
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Coleta, conservação e transporte 
Coleta do escarro 
Escarro de expectoração 
	Qualidade e quantidade do escarro
	Recipiente 
	Local da coleta 
	Números de amostras 
	Orientação do Paciente 
Lavado gástrico 
Lavado brônquico 
Expectoração induzida 
Coleta de outras amostras
	Urina 
	Líquidos assépticos 
	Material de Biópsia 
	Pus 
	Sangue 
	Fezes 
Cerca de 10 ml de amostra. Recipiente com boca larga e rosqueada.
N de amostras: 3
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Identificação de micobactérias 
Bacilos aeróbios
Não esporulados
Imóveis 
Álcool-ácido resistentes (BAAR)
	Parede celular (lipídios-ácidos micólicos
	* Resistência aos antibióticos; BAAR
	*Constituição hidrofóbica da parede celular 
	* Formação de granuloma; 
A maioria desenvolve-se na temperatura de 35°C a 37°C ; De crescimento lento (12 a 24h – uma divisão)
 
Familia acito micetalis.
Micobacterio bovis > produz a vacina BCG 
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Glicolipídio – antigênicos
25% (peso seco)
Polipeptídio (PPD) – antigênicos
15% (peso seco)
Ácido micólico + lipídio livre + arabinogalactano - resistência
Peptideoglicano - arabinogalactano
Estrutura da parede celular 
Espécies de interesse médico 
Importante saber as patogenicas e potencialmente patogenicas
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Espécies de interesse médico 
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 GRUPOS EXEMPLOS
______________________________________________________________
1. Patógeno Obrigatório M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae 
2. Patógeno cutâneo M. marinum, M. ulcerans.
3. Patógeno oportunista M. kansasii, M. avium intracellulare
4. Não ou raramente patógeno M. gordonae, M. smegmatis.
5. Patógeno Animal M. paratuberculosis, M. lepraemurium
______________________________________________________________
Classificação clínica
Espécies de interesse médico 
CULTURA DE MICOBACTÉRIAS 
INTRODUÇÃO 
* Importante para o diagnóstico da tuberculose pulmonar e extra-pulmonar.
* O diagnóstico da forma pulmonar pela baciloscopia requer ≥5.000 bacilos por mL de escarro enquanto que a cultura é mais sensível com apenas 10 bacilos poder ter uma cultura positiva . 
ISOLAMENTO 
DESCONTAMINAÇÃO 
CULTURA 
Lauril sulfato de sódio 
Petroff
Corper & Stoner 
Cloreto de cetilpiridínio 
Métodos
Petroff – multi bacilares – Naoh a 4%
Luril – paucibacilares- Naoh a 1% (viabiliza outras particulas- muco...cel epiteliais)- fluidifica- lisa células q são fagocitárias e deixam livres as micobac... Retira os acidos graxos...
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Método do Lauril sulfato de sódio 
Hidróxido de sódio 1%
 Lauril sulfato de sódio – Agente fluidificante 
Solução A
 Ácido fosfórico -H3PO4 – Agente neutralizante 
 Púrpura de bromocresol ou Azul de bromotimol – 0,4% 
Solução B
 3mL da solução A +2 mL da Amostra – Agitação por 30min – Solução B 
 Centrifugar 
 Desprezar o sobrenadante 
 Semear 0,1mL por tubo contendo meio de cultura 
Amostras paucibacilares 
Método de Petroff
Amostras multibacilares 
* Hidróxido de sódio 4%- Agente descontaminante 
Solução A
Ácido clorídrico 1N – Agente neutralizante +
 Vermelho de fenol a 0,004 % 
Solução B
 5mL da solução A +5 mL da Amostra – Agitação por 30min e incubar por 37°C- Verificar 15, 20 e 30 mim . 
 Adicionar água destilada na mesma quantidade
Neutralizar com a solução B até o aparecimento de uma coloração âmbar 
 Centrifugar 
 Desprezar o sobrenadante 
 Semear 0,1mL por tubo contendo meio de cultura 
Vermelho de fenol:
Se for ácido > fica amarelo
Se for alcalino> fica rosa
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Método de Corper e Stoner modificado 
Amostras paucibacilares 
Solução de fosfato trissódico 23% 
Solução A
Solução de fosfato monossódico -20% 
Solução B
 5mL da solução A +5 mL da Amostra – Agitação por 30min e incubar por 37°C- por 24 horas . 
Neutralizar com a solução B com igual volume 
 Centrifugar 
 Desprezar o sobrenadante 
 Semear 0,1mL por tubo contendo meio de cultura 
1 pra 1!
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Método d Cloreto de cetilpiridínio 
 Método aplicado a conservação das amostras por no máximo 1 semana 
* Método de descontaminação se a amostra tiver contado com o cloreto de cetilpiridínio por no máximo 24 horas 
Solução de cloreto de cetilpiridínio 1% 
 5mL da solução A +5 mL da Amostra – Agitação
 Centrifugar 
 Desprezar o sobrenadante 
 Semear 0,1mL por tubo contendo meio de cultura- Lowenstein-Jensen 
Solução A
Meios de cultura 
Lowenstein-Jensen 
Glicerol, asparagina 
Piruvato de sódio 
Middlebrook 7H9 
Middlebrook 7H10 
Middlebrook 7H11 
São meios sólidos ou líquido 
utilizados para conservação de cepas, preparação de inóculos 
Necessitam de enriquecimento com OADC ou ADC. 
Meio q contamina rapidamente; 
Enriquecido com glicerol, aspar’agina e piruvato de sodio.
Utilização de ovos
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IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS 
Classificação de Runyon
Tempo de crescimento e pigmentação das colônias :
 Grupo I, Grupo II, Grupo III e Grupo IV.
Grupo I- fotocromogênicas 
	* Crescimento lento
	* Pigmento amarelo ao laranja quando exposta à luz
	* tempo de crescimento superior a 10 dias. 
	Exemplos: M. ulcerans, M. marinum e M. kansasii.
Grupo II escotocromogênicas
	* Crescimento lento
	* Pigmento amarelo alaranjado mesmo na ausência da Luz 
	* Exemplos: M. scrofulaceum e M. gordonae.
Grupo III não cromogênicas
	* Crescimento lento 
	* Não produzem pigmento ou pouco
	* Colônias lisas e resistência à isoniazida
	Exemplos: complexo avium –intracellulare 
-Grupo IV pigmentação variável
	Crescimento rápido (-7 dias a 25 ou a 37° C)
	Exemplos M. fortuitum M. smegmatis, M. chelonae 
Crescimento de micobactérias em presença de agentes inibidores 
 O ácido para-nitro benzóico- 500 µg/mL
Complexo tuberculosis – Sensível das demais micobactérias 
Exceto: M. kansasii, M.gastri e M. marinum
 A hidrazida do ácido tiofeno 2 carboxílico (TCH 2 µg/mL)
Complexo tuberculosis – resistente das demais membros do complexo tuberculosis 
 A cicloserina (CS 30 µg/mL)
 M. bovis – resistente das demais membros do complexo tuberculosis
Separa M. szulgai ( resistente), dos demais membros do grupo escotocromogênicas sensiveis 
 A ofloxacina (OFLO 2 µg/mL)
Separa M. fortuitum ( sensível) do M. chelonae ( resistente ) 
 O etambutol (EMB 2 µg/mL)
Separa complexo avium –intracellulare ( resistente) das demais espécies de micobactérias não cromogênicas ( sensíveis)
A pirazinamida (PZA 100 µg/mL)
Separa M. bovis( resistente) do M. tuberculosis ( sensível ) 
IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS
ATRAVÉS DE PROVAS BIOQUÍMICAS 
Tempo de crescimento e produção de pigmento 
Acumulação de niacina 
Redução do nitrato a nitrito 
Catalase termo-estável a 68° C 
 Inibição do crescimento pela Hidrazida do ácido tiofeno-2 carboxílico 
Hidrólise do Tween 80
Atividade da arilsulfatase
 Biossíntese de urease
Crescimento em cloreto de sódio a 5% 
Crescimento em ÁGAR Mac Conkey
Captação de ferro 
Teste de sensibilidade do M. tuberculosis aos antibióticos e quimioterápicos 
Introdução 
A resistência do M. tuberculosis as drogas surge por mutação espontânea. Numa população sensível, existe cerca de 1 bacilo resistente em cada 108 células. 
Indicação 
 Falência de tratamento;
 Retratamento;
 Pacientes com suspeita de resistência primária;
 Vigilância epidemiológica. 
Método das proporções 
Princípio 
Método descrito por Caneti, Rist & Grosset em 1963. 
	Consiste em detectar a proporção de bacilos resistentes numa amostra na qual existe BAAR ou M. tuberculosis. 
	Este micro-organismo será exposto a uma concentração da droga que é capaz de inibir o desenvolvimento das células sensíveis mas não o das células resistentes. Esta concentração da droga é denominada de Concentração crítica. 
Técnica 
 Direta 
 Indireta 
Drogas
Concentraçõesµg/mL
Proporções
%
Isoniazida(INH)
0,2
1
Rifampicina(RMP)
40
1
Pirazinamida(PZA)
100
10
Estreptomicina (SM)
4,0
10
Etambutol(EMB)
2,0
1
Etionamida(ETH)
20,0
10
Ácido paranitrobenzoico(PNB)
500
1
Hidrazida do ácido tiofeno 2-carboxílico(TCH)
2,0
1
Preparação do meio com drogas 
Teste de sensibilidade direto 
Escarro com baciloscopia (+)
Sedimento tratado
10-1
10-2
10-3
0,1mL
0,1mL
0,1mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
4,5 mL de H2O destilada esterilizada 
*Lowenstein-Jensen com droga 
* Controle 
 
*Lowenstein-Jensen com droga 
* Controle 
 
* Controle 
 
Escarro com baciloscopia (++)
Sedimento tratado
10-1
10-2
10-3
0,1mL
0,1mL
0,1mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
4,5 mL de H2O destilada esterilizada 
*Lowenstein-Jensen 
com droga 
* Controle 
 
* Controle 
 
0,5 mL
10-4
*Lowenstein-Jensen com droga 
* Controle 
 
Sedimento tratado
10-1
10-2
10-3
0,1mL
0,1mL
0,1mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
4,5 mL de H2O destilada esterilizada 
*Lowenstein-Jensen 
com droga 
* Controle 
 
* Controle 
 
0,5 mL
10-4
*Lowenstein-Jensen 
com droga 
* Controle 
 
10-5
0,5 mL
Escarro com baciloscopia (+++)
Teste de sensibilidade indireto 
Cultura em Lowenstein –Jensen 
* Suspensão em 1,0 mL de água destilada
*Agitar em Vortex,
* Repousar 
*Gotejar num tubo com 3,0 mL de água destilada até obter turvação comparável ao tubo N° 1 da escala de Mac Farland 
* Transferir 1,0 mL desta suspensão para um tubo com 9,0 mL de água destilada 
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-3
*Lowenstein-Jensen 
com droga 
* Controle 
 
*Lowenstein-Jensen 
com droga 
* Controle 
 
** Controle 
 
Teste de sensibilidade
Leitura 
N° de colônias ( tubo com drogas) ÷N° de colônias 
( tubo controle ) x 100 = % bacilos resistentes 
Correlacionar com % limite existente para cada droga utilizada .