DNA RECOMBINANTE

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Métodos da técnica do DNA recombinante feitos na Escherichia coli
O presente estudo relata a trajetória da ocorrência das infecções pela Escherichia Coli ao longo da história humana e a contribuição da mesma à saúde humana com o desenvolvimento de ferramentas pela Engenharia Genética. 
A PARTIR DO QUE JÁ FOI ABORDADO, O AUTOR RETRATA NA FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA QUE AS...................
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
As bactérias que vivem no lúmen intestinal e demais áreas corpóreas de animais e seres humanos, eram conhecidas por sua patogenicidade como o desenvolvimento de quadros de infecções do trato urinário, bacteremia (é a presença de bactérias na corrente sanguínea), meningite (caracterizada por um processo inflamatório das meninges, membranas que revestem o encéfalo e a medula espinhal. É causada, principalmente, a partir da infecção por vírus ou bactérias; no entanto, outros agentes etiológicos também podem causar meningite, como fungos e parasitos) e doenças diarreicas e demais síndromes clínicas mais comuns. Contudo a espécie bacteriana só apresenta atividade patogênica, quando as defesas naturais são comprometidas e/ou não há resposta imune conhecida ao determinado agente (STELLA, 2009). 
a Escherichia coli é uma bactéria essencial para a biotecnologia moderna. Apesar de ser conhecida por sua natureza, poucas pessoas têm consciência da sua importância em pesquisas e desenvolvimento científicos, sendo ela a principal escolha para técnicas de Engenharia Genética
As bactérias passaram frequentemente a ser utilizadas na engenharia genética por possuir um grande potencial biotecnológico. Nesse cenário, cientistas combinam fragmentos ou partes do DNA de diferentes organismos através do corte e recombinação dos genes. Esse processo acontece primeiramente com a retirada do DNA de um organismo (doador) e separação do gene que será usado.
Em seguida há a combinação desse gene ao DNA de outro organismo, o qual o resultado é um DNA que contém características dos dois organismos. Esse novo DNA é chamado de DNA recombinante. Para realizar mais cópias desse DNA recombinante, os cientistas podem colocá-lo dentro de bactérias, pois quando elas se reproduzem o DNA também se reproduz. Esse processo chama-se “clonagem de genes” e é utilizado na produção de uma infinidade de substâncias para aplicações muito importantes, principalmente na área da medicina, através da reprogramação e produção de anticorpos que atuam inclusive no tratamento de alguns tipos de câncer.
Em 1971, um grupo da Universidade de Stanford, desenvolveu um híbrido de DNA de um bacteriófago lambda e do vírus SV-40, constituindo a primeira molécula de DNA Recombinante. Contudo, só em 1973, Herbert Boyer e Stanley Cohen realizaram o experimento de introduzir o DNA ribossomal de um sapo em um plasmídeo, que foi introduzida na E.coli, observando-se a capacidade de replicação da bactéria (RESENDE, 2015). 
abreviatura para vírus vacuolante símio. 
Desde o nascimento da clonagem molecular, a E. coli tem sido utilizada como hospedeira para sequências de DNA. Em 1973, Hebert Boyer e Stanley Cohen mostraram pela primeira vez que duas partes pequenas de DNA bacteriano poderiam ser “copiadas” e depois “coladas” em E. coli. Logo depois, eles mostraram que o DNA de outros organismos, como os sapos, também poderia ser introduzidos na bactéria. Com o sucesso desses experimentos, a E. coli se tornou a primeira escolha para clonagem molecular e hoje é usada em laboratórios de todo o mundo não só como hospedeira para sequências de DNA, mas também para produção de suas proteínas.
A partir da TDR foi sintetizado o primeiro fármaco, a insulina humana, proveniente de cepas de E. coli. Iniciou-se então uma nova era na obtenção de proteínas em larga escala, podendo ser utilizados outros organismos de origem além da bactéria, como fungos e leveduras. Após o sucesso da comercialização do fármaco, foi possível o manuseio de outros produtos terapêuticos derivados da engenharia genética, como pode ser observado na Tabela 1 (RESENDE, 2015).
Tabela 1: Produtos terapêuticos produzidos através da engenharia genética: Fonte: RESENDE, 2015. (SLAIDE). 
Os avanços da tecnologia proporcionam cada vez mais conhecimentos sobre o genoma dos seres vivos, por isso surgem cada vez mais aplicações para a engenharia genética, como na medicina, pesquisa, agricultura e indústria. Alguns exemplos são as produções, em larga escala, de insulina, de interferon alfa humano com atividade biológica contra infecções ocasionadas por vírus e contra algumas formas de tumores malignos humanos, de vacinas e anticorpos em geral. 
Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo
Hospedeiro é o nome dado a um organismo, independentemente de seu grupo, que atua como “moradia temporária” para outro organismo. 
Plasmídeos são moléculas de DNA extra cromossomal capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico, carregam consigo informações genéticas e até mesmo genes responsáveis por inúmeros casos de restrição a drogas e bactérias.
TÉCNICA DE DNA RECOMBINANTE (TDR)
Com o intuito de manufaturar a insulina artificial, utiliza-se a clonagem da E. coli mutada com o segmento gênico, que representa a produção da proteína e acrescentado a este, um fator de resistência a um antibiótico específico. A bactéria multiplicará em um meio de cultura contendo o antibiótico específico. Isso só é possível, pois ao incorporar os genes, a característica adquirida pelas bactérias torna-se permanente e hereditária (ROSSI, 2001). 
As bactérias possuem em seu citoplasma, pequenos anéis de DNA, denominados plasmídeos, que são diferentes do cromossomo bacteriano. Esses anéis possuem autonomia de replicação e alta capacidade de recombinação, permitindo que sejam muito utilizados na engenharia genética e funcionando como vetores de clonagem
Transformação e seleção bacteriana
Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as E. coli utilizadas em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.
Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.
Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.
Através do processo de reprodução assexuada, serão geradas novas células com as modificações gênicas previamente alteradas. Resultando em células portadoras de vetores com a sequência codificadora da proteína desejada e o marcador de resistência (ZAHA, 2014).
 Para a produção do vetor de expressão genica utiliza-se enzimas de restrição, que rompem a dupla fita do DNA circular bacteriano, inserindo o gene e a DNA-ligase, catalizadora das ligações fosfodiéster. A transformação bacteriana ocorre com a introdução desse vetor no material gênico expresso nas cepas de interesse. Posteriormente o detalhamento das demais etapas envoltas na TDR (ROSSI, 2001).
A tecnologia do DNA recombinante consiste no isolamento de genes de interesse, conduzidos por técnicas de clonagem molecular. Utilizando vetores de clonagem, a sequência é inserida pelaenzima DNA ligase e com o gene de interesse isolado, os fragmentos de DNA são incorporados ao genoma do organismo, o modificando. Portanto na produção de insulina, o gene humano é isolado e recortado por enzimas de restrição e inserido no também isolado plasmídeo da Escherichia coli. A partir daí um plasmídeo recombinante é formado e inserido na célula da bactéria, que codifica o gene humano da insulina, passando a produzi-la.
Transformação & seleção bacteriana
As bactérias podem incorporar DNA exógeno em um processo denominado transformação.
A transformação é um passo fundamental na clonagem de DNA. Ocorre após clivagem e ligação e transfere plasmídeos recém-criados para bactérias.
Após a transformação, as bactérias são selecionadas em lâminas antibióticas. As bactérias com um plasmídeo são resistentes a antibióticos e cada uma formará uma colônia.
As colônias com o plasmídeo sicerto podem ser cultivadas para formar grandes culturas de bactérias idênticas, que são usadas para produzir plasmídeo ou sintetizar proteína.
Passos da transformação e seleção bacteriana
Este é um procedimento típico de transformação e seleção bacteriana:
Bactérias especialmente preparadas são misturadas com DNA (ex., de uma ligação).
Um choque térmico é dado nas bactérias, o que faz com que algumas delas incorporem um plasmídeo. 
Os plasmídeos usados na clonagem contém um gene para resistência a antibiótico. Desta forma, todas as bactérias são colocadas em uma lâmina de antibiótico para selecionar aquelas que incorporaram um plasmídeo.
1. Bactérias sem um plasmídeo morrem. Cada bactéria com um plasmídeo dá origem a um aglomerado de bactérias idênticas, contendo plasmídeo, que são denominadas de colônia.
2. Várias colônias são verificadas para identificar uma com o plasmídeo correto (por exemplo, por PCR ou digestões de restrição).
3. Uma colônia contendo o plasmídeo correto cresce em volume e é usada para a produção de plasmídeo ou proteína.
Produção de proteína
Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.
As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana.
Por que precisamos verificar as colônias?
Todas as bactérias que formam colônias deveriam conter um plasmídeo (que fornece resistência a antibióticos). Entretanto, não necessariamente todas as colônias contendo plasmídeos terão o mesmo plasmídeo.
QUESTÕES: 
1) Qual das seguintes afirmações é verdadeira em relação a clonagem de DNA?
A) Sequências-alvo de DNA são reconhecidas e cortadas por enzimas de restrição.
Correta: enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA e reconhecem uma ou algumas sequências alvo e cortam o DNA em ou perto dessas sequencias 
B) Plasmídeos são geralmente utilizados porque são extremamente complexos.
Incorreto: plasmídeos são usados porque são simples e capazes de transportar quase qualquer gene 
C) DNA recombinante é formado quando células bacterianas se reproduzem assexuadamente. (ALTERADAS)
Incorreto; quando uma célula bacteriana inalterada se reproduz assexuadamente, produzira descendentes geneticamente idênticos a mesma. 
D) DNA ligase reconhece uma ou poucas sequências-alvo no DNA antes que ocorra o corte.
Incorreto: DNA ligase liga fragmentos com extremidades coincidentes uma vez que o DNA foi cortado. 
2) Plasmídeos usados em clonagem contêm um gene de resistência a antibióticos. Como isso ajuda os cientistas?
A) Isso previne que as bactérias infectem os cientistas durante o processo de clonagem.
Incorreta: o gene resistente ao antibiótico faz as bactérias resistentes aos antibióticos, isso não faz os cientistas serem resistentes as bactérias 
B) Todas as bactérias preparadas serão resistentes aos antibióticos.
Incorreta: Só as bactérias com plasmídeo serão resistentes aos antibióticos. Bactérias que não levaram o plasmídeo não serão. 
C) As bactérias sem o plasmídeo serão mais fáceis para os cientistas as identificarem.
Incorreta: bactérias com o plasmídeo serão mais fáceis para os cientistas as identificarem porque eles vão crescer nas placas nutrientes. As outras bactérias vão morrer. 
D) Só as bactérias com o plasmídeo crescerão em placas de nutrientes contendo antibióticos
Correta: após a transformação, todas as bactérias são colocadas em uma placa de antibiótico para selecionar para aquelas que pegaram um plasmídeo. Bactérias sem plasmídeo morrem e bactérias com o plasmídeo crescem em colonias. Isso permite que os cientistas tenham a certeza de que eles tem colonias com plasmídeos desejados 
OBS: Uma célula bacteriana pode conter vários plasmídeos. Por possuir o seu próprio DNA, o plasmídeo pode conter genes relacionados com a resistência aos antibióticos, garantindo a sobrevivência da bactéria. Essa condição torna algumas infecções por bactérias difíceis de serem controladas.
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformation-selection
https://profissaobiotec.com.br/escherichia-coli-uma-ferramenta-importante-para-biotecnologia/#:~:text=%C3%A1rea%20de%20bioinform%C3%A1tica.-,A%20E.,para%20a%20biotecnologia%20do%20futuro.
https://gec.proec.ufabc.edu.br/o-que-que-a-ciencia-tem/e-coli-o-que-e-e-para-que-e-usada/