HAVAb-456P6

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HAV Ab 
Código: Formato: 3 x 12 testes
 
 60456002
 
Versão: 456/P6
 
P 
 
O kit ImmunoComb® II HAV Ab é um teste para a detecção semi 
quantitativa dos anticorpos para o vírus de hepatite A (HAV) em 
soro ou plasma humano. Trinta e seis testes podem ser 
realizados com um kit. 
 
Introdução 
A hepatite A é uma doença freqüente em humanos, causada pelo 
vírus da hepatite A (HAV). Após um período de incubação de 14-
40 dias, a infecção por HAV geralmente se manifesta por icterícia, 
devido à inflamação aguda do fígado e concentrações elevadas 
de bilirrubina no sangue. Não foram reportados casos de infecção 
crônica. 
A hepatite A é endêmica em todas as partes do mundo. Sua 
epidemiologia é acentuadamente influenciada pelo nível local de 
saneamento e higiene. A transmissão ocorre por via fecal-oral. 
Um alto nível de vírus (até 108 unidades infecciosas por grama) é 
excretado nas fezes alguns dias antes da manifestação dos 
sintomas clínicos ou icterícia. A disseminação do vírus é, então, 
facilitada através do contato direto ou através do consumo de 
água ou alimentos contaminados. 
A profilaxia bem sucedida da hepatite A é atualmente obtida por 
imunização passiva com imunoglobulinas anti-HAV humanas. 
Além disso, foram recentemente desenvolvidas vacinas para 
HAV. 
Diversas causas de origem viral (ex. vírus da hepatite B e hepatite 
C) ou não virals podem induzir a hepatite. Conseqüentemente, o 
diagnóstico da infecção por HAV baseado apenas nos sintomas 
clínicos e na avaliação bioquímica das funções hepáticas, é muito 
difícil. Entretanto, o imunodiagnóstico permite a identificação do 
agente etiológico. 
O ensaio HAV Ab facilita a determinação do estado imune de 
indivíduos após exposição ao HAV ou vacina para hepatite A. A 
detecção de anticorpos anti-HAV na ausência de anticorpos do 
tipo IgM anti-HAV, indica tanto uma infecção precoce com HAV 
como uma vacinação bem sucedida. Em geral, um título de 10 
UI/L é considerado como a concentração mínima de anticorpos 
anti-HAV para indicar imunização do indivíduo. 
 
Princípio do Teste 
O teste ImmunoComb® II HAV IgM é um ensaio imunoenzimático 
(EIA) em fase sólida, baseado no princípio de imunocaptura. A 
fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada 
dente é sensibilizado em duas posições: 
Ponto superior – anticorpo monoclonal para HAV (Controle 
Interno). 
Ponto inferior – anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos. 
 
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada 
fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas 
do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de 
fileira a fileira com incubação em cada etapa. 
 
Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são pré-
diluídas a 1:50 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira 
A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades 
da fileira A. IgG e IgM serão capturados pelos anticorpos anti-IgG 
e anti-IgM dos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). 
Os componentes não ligados são removidos por lavagem na 
fileira B. Na fileira C, os anticorpos IgM e IgG anti-HAV 
capturados nos dentes reagirão com antígenos HAV. 
Simultaneamente, os antígenos HAV também se ligarão aos 
anticorpos anti-HAV no ponto superior (Controle Interno). Na 
fileira D os antígenos HAV ligados reagirão com os anticorpos 
monoclonais anti-HAV marcados com fosfatase alcalina (FA). Na 
fileira E, os componentes não ligados são removidos por 
lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com os 
componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como 
pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. 
 
 
 
Figura 1. Princípio do Teste 
 
O kit inclui um Controle Positivo (anticorpos anti-HAV) e um 
Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio para 
confirmar a validação do teste. Ao término do teste, o dente 
usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-
azulados. O dente usado com o Controle Negativo deve mostrar o 
ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O 
ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, 
para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o 
teste foi realizado corretamente. 
Conteúdo do kit 
Pentes 
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um 
dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado 
com duas áreas reativas: 
Ponto superior – anticorpo monoclonal para hepatite A (Controle 
Interno). 
Ponto inferior – anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos. 
 
 
Figura 2. Pente 
 
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo 
dessecante. 
 
Placas Reveladoras 
O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de 
alumínio. 
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes 
necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 
fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: 
 
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Fileira A Diluente de amostra 
Fileira B Solução de lavagem 
Fileira C Antígeno HAV 
Fileira D Anticorpo monoclonal anti-HAV marcado com 
fosfatase alcalina 
Fileira E Solução de lavagem 
Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-
bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de 
nitrotetrazolium (NBT) 
 
 
 
Figura 3. Placa Reveladora 
 
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de 
plasma humano, inativado pelo calor, diluído a um título de 100 
UI/L para anticorpos HAV. 
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma 
humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-HAV. 
Diluente de amostra – 1 frasco (tampa branca) de 20 ml de 
diluente. 
Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as 
cavidades da Placa Reveladora. 
CombScaleTM – para leitura dos resultados do teste. 
 
Segurança e Precauções 
• Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. 
• Todos os materiais de origem humana usados na 
preparação do kit foram testados e considerados não 
reativos para antígeno de superfície da hepatite B, 
anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. 
Como nenhum teste pode garantir completamente a 
ausência de contaminação viral, todas as soluções de 
referência e amostras humanas devem ser manipuladas 
como potencialmente infectantes. 
• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos 
aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. 
• Não pipetar com a boca. 
• Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e 
outros materiais utilizados com o kit como resíduo 
bioinfectante. 
• Não misturar reagentes de lotes diferentes. 
• Não usar o kit após o vencimento. 
 
Armazemamento do Kit 
Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 – 8ºC. Nestas 
condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do 
rótulo. Não congelar o kit. 
Manipulação das amostras 
Tanto o soro como o plasma podem ser testados. 
As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 – 8ºC antes 
do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as 
amostras a –20ºC ou inferior. 
Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. 
Testar o sobrenadante. 
Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. 
 
Procedimento do Teste 
Material Necessário 
• Pipetas de precisão ajustáveis e ponteiras descartáveis para 
dispensar 10 µL, 25 µL e 490 µL. 
• Tesoura. 
• Cronômetro ou relógio de laboratório. 
• Microtubos 
 
Preparando o Teste 
1. Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, 
reagentes e amostras à temperatura ambiente. 
2. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 
45 minutos. 
3. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser 
descartado como resíduo bioinfectante no final doteste. 
4. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. 
Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. 
Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da 
pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas 
instruções do Teste. 
Preparando o Pente 
Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, 
não tocar nos dentes do pente. 
1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade 
marcada. Remover o Pente. 
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou 
parcialmente. Para usar parte de um pente: 
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as 
amostras e controles. Você precisa de um dente para cada 
teste. Cada dente mostra o número “56” do código do kit, 
para permitir a identificação dos dentes destacados. 
b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a 
tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário 
de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). 
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem 
de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, 
por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o 
Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior. 
 
Figura 4. Quebrando o Pente 
 
Instruções do Teste 
Pré-diluição de Amostras e Controles 
1. Para cada amostra e controle, dispensar 490 µL do diluente 
de amostra em um microtubo. 
2. Para cada microtubo, adicionar 10 µL de uma amostra ou do 
Controle Positivo ou Controle Negativo fornecidos no kit. 
Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes. 
 
Captura de Anticorpos (Fileira A da Placa Reveladora) 
Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem 
devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 - 26ºC). 
3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a tampa 
de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa 
Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e 
dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar 
repetidamente enchendo e esvaziando a ponteira com a 
solução. Descartar a ponteira da pipeta. 
4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os 
dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira 
A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 
5. a) Colocar o Pente (o lado impresso de frente para você) 
nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. 
Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias 
vezes. 
b) Deixar o Pente na fileira A e incubar por 2 horas a 37ºC. 
Ajustar o cronômetro. Misturar mais três vezes (a cada 30 
minutos) durante a incubação. Próximo ao final de 2 horas, 
perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não 
abrir mais cavidades que o necessário. 
c) Ao final de 2 horas, retirar o Pente da fileira A. Absorver o 
líquido residual nas pontas dos dentes em papel 
absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. 
Primeira lavagem (Fileira B) 
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e 
inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar no 
mínimo 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. 
Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; 
neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 
minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como 
no passo 5c. 
Reação antígeno-anticorpo (Fileira C) 
 
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7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no 
passo 5a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 30 
minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as 
coberturas da fileira D. Misturar mais uma vez durante a 
incubação. Após os 30 minutos, retirar o Pente e absorver o 
líquido residual. 
Ligação do Conjugado (Fileira D) 
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a 
Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o 
cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. 
Misturar mais uma vez durante a incubação. Após 20 
minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. 
Segunda Lavagem (Fileira E) 
9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar 
repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Perfurar 
as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e 
absorver o líquido residual. 
Reação de Cor (Fileira F) 
10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Incubar 
a Placa Reveladora com o Pente por exatamente 10 minutos 
(ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o 
Pente. 
Reação de Parada (Fileira E) 
11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar 
o Pente e deixar secar ao ar livre. 
Descarte do lixo 
Descartar as Placas Reveladoras utilizadas, ponteiras, 
microtubos, papel absorvente e luvas, como lixo bioinfectante. 
Armazenamento da parte não utilizada do kit 
Placa Reveladora 
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, 
podem ser guardadas para uso posterior: 
• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a 
evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido 
esvaziada. 
Outros materiais do kit: 
• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, 
perfurador, controles e instruções de uso ao kit. 
Armazenar de 2 - 8ºC. 
 
Interpretação dos Resultados 
Validação 
Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar 
que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem 
ser cumpridas (veja Figura 5). 
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do 
Pente. 
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior 
(Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou 
aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos 
resultados. 
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior 
(Controle interno). 
Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados 
são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. 
 
Controle 
Positivo
 
Controle 
Negativo
Resultados
Inválidos 
 
Figura 5. Validação dos testes. 
 
Leitura e Interpretação dos Resultados 
Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual 
O nível de anticorpos anti-HAV em cada amostra pode ser 
estimado pela comparação da intensidade de cor do ponto inferior 
de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com 
o kit: 
 
 
Figura 6. CombScale 
 
1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente de 
Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante 
à escala de cores. Ajustar a régua de modo que “100; C+” 
apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 
2. Ler os resultados sem alterar a posição de calibração da 
régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior 
com a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Um 
ponto com intensidade maior ou igual à do ponto do cutoff 
(10 UI/L) indica a presença de um título de proteção de 
anticorpos anti-HAV. Um ponto com uma coloração 
ligeiramente inferior à do cutoff deve ser considerada como 
resultado duvidoso e a amostra deve ser retestada. Um 
ponto com intensidade menor que a do cutoff deve ser 
considerado como resultado negativo. 
 
Leitura no Equipamento 
O refletômetro do CombScanTM (ver o Manual de Uso do 
Combscan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida 
e objetiva da intensidade da cor dos pontos no ImmunoComb. Ler 
os resultados como absorbância relativa usando o programa # 92 
do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando 
“1” quando aparecer a mensagem “pontos: 1,2,3” na tela. 
Valores de absorbância relativa de 350 (< 10 UI/L) ou inferiores 
são soronegativos para anticorpos para HAV. 
Valores de 350-400 são duvidosos e a amostra deve ser 
retestada. Valores de 401 ou superiores são considerados como 
resultados positivos (> 10 UI/L). 
 
Documentação dos resultados 
Como a cor desenvolvidano Pente é estável, os pentes podem 
ser guardados para documentação. 
 
* Baseado na calibração usando o padrão da OMS de 
imunoglobulina anti-HAV W1041. 
Limitações 
O kit ImmunoComb® II HAV IgM é um teste de triagem. 
Resultados do teste que indicam que uma amostra é reativa para 
anticorpos para HAV não devem ser considerados como 
diagnóstico de infecção por hepatite A ou imunização para HAV. 
Os resultados dos testes devem ser avaliados em conjunto com 
todos os sintomas, históricos clínicos e outros testes laboratoriais 
realizados para o paciente. 
 
Características de Desempenho* 
A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HAV 
Ab foram avaliados pela comparação com kits EIA de referência 
em 690 amostras: 596 amostras de doadores de sangue 
voluntários, 94 amostras de pacientes com infecção aguda ou 
passada por HAV. Os resultados destes testes estão resumidos 
na Tabela 1. 
 
Tabela 1. Comparação do ImmunoComb HAV Ab com EIA de 
referência na determinação de anticorpos para vírus da 
hepatite A. 
• Sensibilidade – 97,3% 
• Especificidade – 98,3% 
• Concordância geral: 98,0% 
ImmunoComb II HAV Ab EIA de 
Referência Positivo Negativo 
Positivo 257 7 
Negativo 7 419 
 
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As reações cruzadas com amostras positivas de hepatites 
causadas por agentes, tais como o vírus da hepatite B ou C, 
citomegalovírus, vírus Epstein Barr, herpes simples e toxoplasma 
foram encontradas insignificantes. 
A interferência com amostras hemolisadas, lipêmicas e com 
bilirrubina alta foi encontrada insignificante. Amostras de 
pacientes com fator reumatóide (FR) e doenças autoimunes não 
interferem no teste. 
Os anticoagulantes testados, como heparina, EDTA e citrato de 
sódio não tiveram nenhum efeito nos resultados do teste. 
 
* Informação detalhada disponível mediante solicitação. 
 
Bibliografia 
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Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven 
Press, New York, pp 1-37. 
Decker R, Ling CM, Overby L. Frosner GG, Boggs J. 1976. 
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Dienstag JL, Krugman S, Wong DC, Purcell RH. 1976. 
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Duemeyer W. Van der Veen J, Koster B. 1978. ELISA in 
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Herrera JL. 1994. serological diagnosis of viral hepatitis. S. Med. 
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Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens 
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antigenin urban adult populations. N engl J Méd. 295: 755-759. 
Zaaijer HL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman H and Lelie PN. 
1993 Hepatitis A antibody titres after infection and immunization; 
Implications for passive and active immunization.JMéd.Virol 
40:22-27 
 
Produzido por: 
ORGENICS LTD. 
P.O.Box 360, Yavne 
70650 - ISRAEL 
 
Registro e Distribuição: 
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Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista 
04070-030 São Paulo - SP 
CNPJ : 01.767.606/0001-10 
 
Atendimento ao consumidor 
SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 
e-mail: orgenics@uol.com.br 
 
Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" 
 
Registro ANVISA nº 10348680035 
 
Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva 
CRF-SP 13020 
 
CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel
h t t p : / / w w w . o r g e n i c s . c o m
 
 
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Resumo dos Principais Procedimentos do Teste 
 
 
 
Resumo do Procedimento de Teste 
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HAV Hb. 
 
(Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo) 
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 
2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra e controle misturando com 490 µL do diluente da amostra. 
3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa 
Reveladora. 
4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. 
 
Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste 
 
Etapa Fileira Proceder como a seguir 
Captura de anticorpos 
 
A Misturar; incubar por 2 horas a 37ºC; absorver. 
Lavagem 
 
B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. 
Reação antígeno – 
anticorpo 
 
C Misturar; incubar por 30 minutos a 37ºC; absorver. 
Ligação do conjugado 
 
D Agitar; incubar por 20 minutos a 37ºC; absorver. 
Lavagem 
 
E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. 
Reação de cor 
 
F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC. 
Reação de parada 
 
E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre.