Genoma Humano

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Medicina Cesmac
anabeatrizcantarelli@outlook.com
Genoma Humano
O fim do Projeto Genoma Humano foi publicado em 2001. O que seria isso? Eles pegaram as nossas 3,2 bilhões de bases de nucleotídeos e sequenciaram. A partir disso, sabemos qual a sequência, quantos genes nós temos, onde eles estão e sempre tentamos associá-los para pensar nas doenças. O grande problema do Projeto Genoma é que ele trouxe muito mais perguntas do que respostas. Esperava-se que tivéssemos 100.000 genes, descobriram que temos de 20 a 25.000 genes. Percebe-se, contudo, que esses genes estão repetidos, e espalhados pelo nosso genoma.
Pensava-se que iria ser muito simples, apenas identificando o genoma seria possível identificar os genes e trocá-los, quando na verdade é extremamente complexo. MANIPULAR É O PROBLEMA. O projeto genoma foi um pequeno alicerce para se pensar em manipular genes. Claro, para manipulá-los tem que saber onde eles estão e isso já é possível a partir desse projeto (quantos genes tem cada cromossomo, onde estão, qual a maioria da função), mas isso não é suficiente.
Os testes para aprovação de um remédio X são feitos em um grupo de pessoas durante Y anos, normalmente em países diferentes do Brasil, ou seja, eles não são testados em brasileiros, não são nossos. A maioria é importada. Embora sejamos muito semelhantes, temos uma diversidade, e é nela que a resposta ao medicamento é diferente. Por isso, caminhamos para uma farmacogenética em que os remédios serão baseados no nosso DNA.
Já é possível fazer diagnósticos pré-implantacionais graças ao genoma. Mas, ainda não é possível, contudo, intervir no indivíduo adulto, todavia pode-se obter um diagnóstico precoce ou a predisposição genética (identificar a mutação mesmo que a pessoa ainda não tenha desenvolvido a doença). As vantagens e desvantagens disso é outra discussão, mas é importante pontuar que foi genoma que tornou isso possível. É pela complexidade que não se tem as respostas necessárias para mais tratamentos baseados no genoma. O que é genoma? Genoma é toda informação hereditária de um organismo que está codificada no seu DNA, com exceção de alguns vírus que tem como genoma o RNA, mas nos seres vivos que tem células, tem sempre como material genético o DNA. A Genômica Funcional é um campo específico da Biologia Molecular que quer saber a função dos genes. É o estudo que procura saber não só a estrutura, mas qual a função do genoma. 
Todos os projetos genomas só foram possíveis graças ao desenvolvimento da PCR. Até hoje, para que você faça o genoma de uma pessoa, você precisa executar uma Reação em Cadeia em Polimerase (PCR). Você precisa de primers, dNTP, tudo o que já foi citado, anteriormente. 
O nosso genoma tem 3 bilhões de pares de bases, imaginem que desses, apenas 1,1% é formado por EXONS. Então, teoricamente, o resto não serve pra nada. Ou não, podem estar envolvidos com os microRNA ou em algo que a gente ainda não sabe. Por isso que é muito arriscado que aquela parte não serve para nada. O que podemos falar é que pequena parte daquele genoma parece ser ativa. 
ETAPAS PARA SEQUENCIAR O GENOMA:
Pega o genoma enorme corta em pedaços usando enzimas de restrição (endonucleases saem cortando todo o genoma) Fragmentos clonados para ter grande quantidade deles individualmente com as bactérias (Biblioteca genômica) Junta os pedaços depois que sequenciar.
A Superposição em sequências para o mapa de sequência de um genoma é um trabalho que leva tempo. O soft monta no possível molde. A chance de estar errado é mínima. No início, até poderia estar errado, mas, hoje em dia, é impossível. O soft de hoje em dia impossibilita que isso esteja errado, o principal mecanismo disso: Marcação utilizando uma fósforo 32 para marcar os nucleotídeos, técnica descoberta por Frederick Sanger que ganhou o Nobel. Se não fosse isso não haveria nenhum Projeto Genoma.
O DNA é cortado sempre com enzimas coesivas (endonucleases que cortam de forma coesiva), porque elas podem sobrepor. Elas podem também sobrepor em outro lugar, por isso que utilizam várias enzimas diferentes e por isso que o soft faz repetições de genoma em cada vez e compara qual seria a mais correta, qual padrão que mais se repete. Mas quem faz isso são programas, isso não é feito de forma manual. Mas é assim que é feito usando endonucleases. Depois que corta o genoma, os pedaços são clonados em plasmídeos – a mesma coisa que é feita para produzir a insulina humana Usa-se bactérias e clona isso em plasmídeos para que essas bactérias produzam insulina para gente. 
Fonte inesgotável de bactérias replicando, vivas numa placa de Petri com meio de cultura (glicose), a 37ºC Biblioteca genômica.
Ele pegou quatro tubos diferentes, microtubos, e colocou em cada um deles uma base marcada (uma base distinta por tubo. Ex: tubo um a base marcada foi a guanina, no outro a adenina.). Por qual motivo ele colocou em tubos separados? Por que aqui vão ficar todas as adeninas. E em uma seqüência como o seqüenciador identifica as bases que a compõe? Ele identifica pois você irá fazer uma reação de PCR normal, o primer vai começar a seqüenciar, a DNApolimerase vai colocando as bases correspondentes e até quando chegar o momento da adenina marcada entrar. Caso seja o marcador a PCR vai parar e o seqüenciador sabe a posição do nucleotídeo, a adenina (conforme o exemplo).
Então outro ciclo de PCR inicia: a dupla fita é separada, o primer é fixado, a DNApolimerase vai colocando as bases, dentre elas adeninas não marcadas e por isso a síntese continua, parando apenas quando um nucleotídeo marcado entra. Assim, esse processo é repetido em todos os tubos, para que os nucleotídeos sejam marcados. Depois é feito um gel com essas seqüências, que pelo tamanho o seqüenciador é capaz de identificar cada base. O principio dessa técnica é que a modificação do nucleotídeo permite a interrupção da síntese, que concede ao equipamento a possibilidade de identificar o nucleotídeo “de parada”, ou seja, o nucleotídeo marcado. Esse método, que permite o seqüenciamento clássico, é chamado de Método de Sanger. 
Esse é o método de Sanger, em que você usa os dideoxy, os nucleotídeos marcados. Foi a partir dessa técnica que o seqüenciamento do genoma humano até 2001 foi feito. Hoje em dia esse método não é mais utilizado, pois é muito trabalhoso. Atualmente é feito o seqüenciamento de nova geração, em que o lazer reconhece a cor dos nucleotídeos, que anteriormente foram marcados com cores distintas, funcionando como fluoróforos (algo que emite cor).
No projeto genoma, como identificaram o que ali dentro é gene? Fazendo o processo inverso das proteínas, indentificando as regiões promotoras (TATA box) e cauda poli A(é uma ponta de um lado e outra ponta do outro, então eles identificam região promotora e região de término. Se tiver isso é possível que seja um gene). E quer dizer que onde tiver um “AUG” já é uma metionina, então A TATA box é uma região promotora altamente conservada, todo gene eucariótico antes de começar ele tem no início essas regiões promotoras, então os primers começaram a procurar regiões TATA box porque essas regiões mostram que ali é um possível gene. Quando você pega o gene você tem essa parte e é essa parte que vai ser transcrita e vai virar o RNA mensageiro, mas tem uma parte antes dessa que faz parte do gene que a gente chama de região promotora que tem umas sequências (como a TATA box). 
Podemos partir da proteína, tentar montar o mensageiro e tentar chegar mais ou menos ao gene. Mesmo tendo havido o splicing isso não impede de fazer a busca. Pois, se formos procurar o mensageiro na sequência pra encontrar o encaixe perfeito nunca vai achar, então o software através de estatística) já sabe disso, ele vai procurando no genoma até encontrar um possível gene.
Foi por essas estratégias (procurar regiões promotoras e de término e fazendo o caminho inverso) que chegamos a conclusão que nós temos mais ou menos 25 mil genes, quando se esperava no mínimo 100 mil (porque nós temos 100 mil proteínas). E como éque 25 mil genes formam 100 mil proteínas? Splicing alternativo que junto com os íntrons remove éxons também. Então um gene mesmo sendo igual ele pode gerar mais de 5 tipos de proteínas. Por isso que aquela história de “um gene, uma proteína” está completamente errada. 
Next Generation Sequencing, é a mais nova tecnologia, você compra os kits, eles já vem prontos, faz uma PCR; não bota DNTP normal, só bota a DNTP do kit que é marcado por fluorescência, e aí o software com laser já mostra a sequência... (foi o famoso enterro do Sanger que é o método clássico). Sequenciaram utilizando a metodologia de nova geração, muito mais rápido do que o outro processo; ele foi publicado na Nature (o DNA do Watson). O primeiro genoma humano foi apenas o conjunto haploide, tá? 23 cromossomos, mas agora ele sequenciou os 46... então todos os homólogos foram sequenciados e sempre utilizando os homens por causa do Y.
Qual a aplicabilidade disso? Várias: diagnóstico precoce, testes pré implantacionais, farmacogenômica, nutrigenômica... são algumas possibilidades do projeto genoma. Pra hoje, será que existe algo que pode ser feito? As terapias gênicas. O que é isso? É você pegar o indivíduo já doente, já adulto (desenvolvido quando comparado ao feto) retiro as células do corpo (ex vivo)... Eu retiro as células do corpo, modifico e jogo de novo lá dentro. Ou eu posso modifica-las dentro do corpo mesmo (in vivo).