Sorologia I

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DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA 
VETERINÁRIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE VETERINÁRIA
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA E IMUNOLOGIA
Regente: Prof.Dr. Telmo Vidor
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Interação ag x ac:
Reação de aglutinação
Ac HOMÓLOGOS REAGEM COM D.A. DE SUPERFÍCIE DO Ag.
RESULTANDO NA AGLUTINAÇÃO
( FORMAÇÃO DE GRUMOS QUE
PODEM SER VISTOS A OLHO NÚ) 
+
Ag. (PARTÍCULAS)
AGLUTINAÇÃO
IMUNO - TV
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Soroaglutinação
Efeito pró-zona
SORO COM EXCESSO
DE ANTICORPOS
+
ANTIGENO
BLOQUEIO NA FORMAÇÃO
DE PONTES
IMUNO - TV
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Interação ag. X ac.:
Aglutinação passiva
+
ANTICORPO
ANTI Ag
AGLUTINAÇÃO
LATEX COM
Ag
IMUNO - TV
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Interação ag x ac :
Inibição da aglutinação passiva
GRAVIDEZ
NEGATIVA
+
+
URINA SEM
GCH
SÍTIOS ANTI-GCH
LIVRES
AGLUTINAÇÃO
IMUNO - TV
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Interação ag x ac :
Inibição da aglutinação passiva
GRAVIDEZ
POSITIVA
+
+
URINA COM
GCH
ANTI-GCH
BLOQUEIO DOS
SÍTIOS ANTI-GCH
LATEX COM
GCH
NÃO AGLUTINA
IMUNO - TV
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Reação de Precipitação
AG + EXCESSO DE AC
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Reação de Precipitação
AG + AC EM PROPORÇÕES ÓTIMAS
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Reação de Precipitação
AC + EXCESSO DE AG
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Interação ag x ac : imunodifusão
LINHA DE PRECIPITAÇÃO
NO ENCONTRO do Ag X Ac
SENTIDO RADIAL DA
DIFUSÃO DO Ag e Ac
Gel de
Agar
IMUNO - TV
Ag
Ac
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Modelos de distribuição
de reagentes
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1 e 4	 Ac. padrão
7	 Ag. padrão
2,3,5 e 6- soros de campo
2,4 e 6 Ac. padrão
7	 Ag. padrão
1,3e 5 - soros de campo
IMUNO - TV
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LINHAS DE
IDENTIDADE
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Imunodifusão: reações observadas
Soros de campo 1 e 3 negativos;
Soros de campo 2 e 4 positivos,
Obs.: soro 2 positivo mais fraco
 que soro 4. 
Soros de campo 1 e 2 positivos;
Soro de campo 3 negativo.
Obs.: soro 2 positivo mais fraco 
 que soro 1.
Linha de
IDENTIDADE
Roseta A
Roseta B
IMUNO - TV
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Imunodifusão:
Reações observadas
1
2
3
4
SP
SP
 Sistema
 Soro padrão : anti Língua Azul(LA)
 Antígeno : vírus (LA) em céls. BHK
Reação A :
O Ag. foi reconhecido pelo soro padrão;
o soro 4 (Bovino vac. contra Aftosa), re-
conheceu proteínas de BHK, presentes 
no Ag. do vírus da L. Azul. Formou-se 
uma linha de NÃO IDENTIDADE.
Reação B :
O Ag. foi reconhecido pelo soro padrão
e pelos Acs. do soro 2 (anti LA). No 
entanto o soro 2 também reconheceu as
proteínas BHK . 
Formou-se uma linha de ESPORÃO.
A
B
Ag
IMUNO - TV
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Identidade e não identidade
ASIAN
N’ASE
(N2)
HONG
KONG
HÁ (H3)
ASIAN
N’ASE
(N2)
HONG
KONG
HÁ (H3)
EQUINE 2
H A
 (HEQ2)
EQUINE 2
H A
 (HEQ2)
ANTISORO
HONG KONG
(H3 N2)
Teste de Geldifusão
ilustrando uma análi-
se das relações entre
os antígenos dos en-
velopes dos vírus
 INFLUENZA A
IMUNO - TV
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Reações de identidade e não identidade
SORO
ANTI
BOVINO
SORO 
BOVINO
SORO 
BOVINO
SORO 
BOVINO
SORO
CAPRINO
SORO
CAPRINO
SORO
CAPRINO
IMUNO - TV
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Reações positivas e negativas para Leucose Bovina
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Reação de Mancini :
gel difusão 
quantitativa 
Ag = Anti IgA (5 mg/100)
incorporado ao Agar
IMUNO - TV
Linha de precipitação
1
3
2
1,2,3 = Padrão Ig A (3,6,9 mg)
Demais = material de campo
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Gel Difusão Quantitativa
**Reação de MANCINI**
Meio com anti-Ig A (5mg./100)
Padrão de Ig A
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Diâmetro ao quadrado
 03 06	 09 10,5 mg	 
21
IMUNO - TV
	
	As reações entre os antígenos e anticorpos podem ser detectadas por diferentes metodologias. São conhecidas pela denominação genérica de Reações Sorológicas. No entanto, para cada tipo de reação entre o Ag. e os Ac., existe um método mais indicado, dependendo principalmente dos parâmetros: Sensibilidade / especificidade. Além disso, deve-se levar em conta também, a praticidade e custos. As reações sorológicas são utilizadas com a finalidade de detectar anticorpos ou identificar antígenos.
	Neste capítulo serão abordados os principais reações sorológicas. 
	Como o nome está indicando, a interação dos Acs. com o Ag., resulta em aglutinação. A reação pode ocorrer com qualquer tipo de antígeno. Entretanto, para que seja visualizada, o Ag. deverá ser corpuscular, ou seja de tamanho suficiente para formar grumos quando aglutinados. Esta reação é utilizada para diagnóstico de algumas doenças animais, tais como salmonelose das aves ou brucelose dos bovinos, onde os anticorpos são pesquisados. 
	No teste para brucelose bovina, são distribuídas gotas de soro nos volumes de 0,08; 0,04 e 0,02 ml, sobre uma placa de vidro com pipeta especial para esta finalidade, conforme o esquema abaixo. Acrescenta-se 0,03 ml do antígeno padronizado, misturando-se bem no sentido da maior para a menor diluição (de 0,02 para 0,08). Espera-se durante 4 minutos e inclina-se a placa levemente contra um fundo escuro com luz indireta. Nas reações positivas pequenos grumos poderão ser vistos. Nas negativas, a mistura apresenta aspecto leitoso.
	O esquema a seguir mostra as possibilidades de resultados:
	 		Antígeno padrão
 Soro	 	0,03	0,03	0,03	0,03
(1:25)	0,08	pos.	pos.	pos.	neg.
(1:50)	0,04	pos.	pos.	neg.	neg.
(1:100)	0,02	pos.	neg.	neg.	neg.
Resultado:		pos.	susp.	neg.	neg.
	
	Em algumas situações pode-se obter resultados negativos, quando na realidade são positivos. Esse fato é conhecido como “Efeito Pró-zona”. Sua ocorrência é observada quando um animal sofre uma infecção aguda e apresenta uma resposta imune muito forte. Ao realizar o teste se observam reações negativas nas diluições menores do soro. No entanto, nas diluições maiores, as reações passam a ser positivas. Como mostra o desenho, isso se deve pela presença excessiva de anticorpos que bloqueiam os sítios de reação, não permitindo que as pontes se formem e a aglutinação ocorra. Se os soros forem diluídos, notar-se-á que as reações passam a acontecer.
	A suspeita de se estar frente a um caso de efeito pró-zona ocorre quando os animais testados resultam negativos na reação de aglutinação, tendo apresentado todos os sinais clínicos e evidências da doença. Nesta situação, recomenda-se então repetir o teste, utilizando as maiores diluições dos soros. O animais que forem verdadeiramente portadores da doença terão resultados positivos. Caso o teste persista negativo, é porque o problema é outro. 
	Na aglutinação passiva se utiliza um artifício para detectar uma reação de antígenos muito pequenos com seus anticorpos homólogos. Partículas inertes, conhecidas pelo nome genérico de látex. são utilizadas para esta finalidade. Os antígenos são preparados no laboratório e adsorvidos na superfície do látex. Essas partículas de látex são especialmente preparadas, de modo que os antígenos ficam fortemente ligados a ela. Quando anticorpos específicos forem misturados com esse “látex sensibilizado”, haverá o reconhecimento das partículas fixadas e ocorrerá a reação de aglutinação, que poderá ser observada a olho nu. 
	
	Baseados no fato que os antígenos fixados na superfície do látex são reconhecidos pelos anticorpos específicos, pode-se identificar sua a presença numa reação de inibição. É o caso da Inibição da aglutinação passiva para diagnóstico de prenhes. Sabe-se que as fêmeas prenhes eliminam GCH na urina ou os títulos são elevados no soro.
	Num primeiro momento mistura-se a urina ou soro com um soro anti-GCH. Existem duas possibilidades: caso haja presença de GCH no soro/urina, ele reagirá com os anticorpos. Caso não haja, o anticorpos conhecidos anti-GCH, ficarão livres;
	Num segundo momento, coloca-se sobre a mistura soro anti-GCH + urina/soro, uma suspensão de látex sensibilizados com GCH.	
	No primeiro caso, como houve reação
entre o soro anti-GCH e o GCH eliminado na urina ou presente no soro da fêmea, não haverá anticorpos livres para aglutinarem as partículas de látex sensibilizados.
	No segundo caso, como sobrou anticorpos anti-GCH, estes reagirão com o GCH adsorvido nas partículas do látex, ocasionando aglutinação.
	No primeiro caso, o teste será positivo e no segundo, negativo.
Sem texto
Sem texto
Sem texto
	Algumas rações entre o Ag.x Ac, resultam na formação de precipitados. Nesse caso as moléculas se arranjam como se fossem cristais e ao se acumularem podem ser visualizados. Para que isso se torne praticável, utiliza-se gel de agar na concentração de 1% fundido em tampão fosfato ou tris. Após endurecimento se produz cavidades com furadores especiais e numa cavidade se coloca o Ag e em outra o Ac. Como o agar é fibroso, tanto o Ag. como o Ac. se difundem em todas as direções. Quando se encontram, reagem e precipitam formando uma linha com aspecto leitoso que pode ser melhor visualizada com iluminação indireta e sob fundo escuro.
	Quando as concentrações do Ag e Ac, forem equivalentes, a linha de precipitação será observada no meio da distância entre as cavidades. Quando porém, um dos reagentes estiver em maior concentração, por possuir maior capacidade de difusão, fará com que a linha se forme mais próxima da cavidade onde o reagente é menos concentrado. 
	Existem diferentes maneiras de distribuir os reagentes, visando obter linhas de precipitação. Entretanto, para o diagnóstico, as formas mais práticas e utilizadas são as mostradas nas figuras.
	Na figura à esquerda, são utilizadas as cavidades 1 e quatro para colocar o soro padrão conhecido e na cavidade central, coloca-se o antígeno também conhecido. Entre essas cavidades deverá se formar obrigatoriamente, a linha de precipitação. Nas outras cavidades se colocarão os soros dos animais a serem testados (soros de campo). Esta disposição, favorece um maior rendimento, pois serão colocados em cada roseta, 4 soros de campo. No entanto, ter-se-á somente um ponto de referência para a reação.
	Na figura à direita, a distribuição do soro padrão é feita em cavidades alternadas, oferecendo dois pontos de referência para a reação. Nesse caso, a roseta terá menos um soro e seu rendimento será menor. No entanto por haver dois pontos de referência, haverá maior segurança na leitura dos resultados.
	A experiência do técnico e a responsabilidade dos resultados, é que determinará o tipo de distribuição a ser adotado.
	 
	As reações observadas nas duas rosetas do desenho, mostram o que foi dito no slide anterior sobre os pontos de referência para a leitura dos resultados.
	Quando se forma uma linha de precipitação entre as linhas dos soros padrões e um soro de campo, unindo as extremidades, diz-se que trata-se de uma linha de identidade. Se os componentes (soro padrão reconhecendo o Ag) e o soro de campo reconhecendo o mesmo antígeno, pode-se afirmar que os anticorpos dos dois soros são idênticos, por isso linha de identidade.
	Como foi dito anteriormente, podem ser observadas linhas de precipitação mais próximas do Ag ou soro, dependendo das concentrações de cada um. Quanto mais concentrado for o reagente, mais longe de si, será a reação. 
	A figura mostra as reações A e B. Na reação A são observadas duas linhas que se cruzam, mostrando que dois componentes diferentes do Ag foram reconhecidos pelos dois soros; o soro padrão reconheceu as proteínas do vírus da língua azul e o soro de campo reconheceu uma outra proteína que estava junto com o vírus. Ora, como está dito, o Ag. da língua azul, foi preparado em células de rim de hamster (BHK - Baby Hamster Kidney). Acontece porém que o vírus para vacina contra a Febre Aftosa também é preparado na mesma linhagem de célula (BHK). Logo, a conclusão que se chega, é que o soro do animal (4), possui anticorpos contra as proteínas da células BHK, também presentes no antígeno.
	A reação B, mostra dois soros que reconhecem o mesmo antígeno. A linha de identidade, mostra que o soro de campo está reconhecendo o antígeno da língua azul, mas também outro componente (proteínas do BHK), cuja linha segue em direção a outra cavidade, numa linha de não identidade. Este tipo de linhas são conhecidas por linhas de esporão.
	Exercício: tente explicar as reações de identidade e não identidade entre as proteínas dos vírus influenza humana (Hong Kong) e Influenza eqüina (Equi 2).
	Exercício: tente explicar as reações entre o anti soro bovino com o soro bovino e o soro caprino (soro integral). 
	Sem texto.
	Enquanto que a reação radial mostrada anteriormente é uma reação qualitativa, a reação de Mancini é uma prova quantitativa, ou seja ela serve para medir a concentração dos anticorpos (ou do Ag).
	No slide é mostrado um exemplo, onde o objetivo é titular anticorpo do tipo IgA. Incorpora-se no agar uma concentração conhecida de soro padrão anti IgA (5 mg em 100 ml). Após coloca-se em três cavidades diferentes concentrações proporcionais e crescentes de um padrão IgA. (3, 6 e 9 mg), visando determinar uma linha reta padrão.
	Mancini demonstrou que o diâmetro de difusão elevado ao quadrado, é proporcional à concentração do Ag e que uma vez conhecidos os valores dos padrões, pode-se determinar as concentrações do Ag.
	Então, determina-se a linha padrão e lança-se os valores do quadrado dos diâmetros observados nos soros de teste no eixo Y e projeta-se sobre o eixo de X, obtendo o resultado. (Ver slide seguinte).