Apostila Prática de Citologia

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Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde
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PRÁTICAS DE CITOLOGIA�
Intestino Delgado. Microvilosidades. Os núcleos foram corados em azul e a actina, proteína do citoesqueleto presente no citoplasma, e que sustenta a membrana plasmática, corada em vermelho. Microscopia de fluorescência multifotônica.
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Etel Rocha Vieira
Angélica Pataro Reis
Enfermagem, Farmácia, Fisioterapia, Nutrição, Odontologia
DCB
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS�
UTILIZAÇÃO DO LABORATÓRIO DE CITOLOGIA
Você utilizará este microscópio por este semestre. Cada aluno ou dupla utilizará sempre o mesmo microscópio e também a mesma caixa de lâminas em todas as aulas, os quais receberam números de registros e estarão sob a responsabilidade do aluno ou da dupla. O equipamento é caro, delicado e seu manuseio requer perícia e cuidados. Somente manipule este ou qualquer outro equipamento no laboratório se tiver sido orientado para tal. As dúvidas poderão ser sanadas com os professores, técnicos, monitores ou estagiários QUE TENHAM COMPETÊNCIA PARA TAL.
A utilização do laboratório para revisão de alguma matéria ou outra finalidade somente poderá ser realizada com a devida presença dos monitores, estagiários ou professores os quais anotarão no livro de registros presente no laboratório.
Visitas ao laboratório por alunos fora do horário de aulas serão registradas pelo monitor, assim como os equipamentos ou reagentes por eles utilizados.
Qualquer problema com peça, equipamento ou reagente deve ser imediatamente comunicado ao monitor, técnico ou estagiário que anotarão no livro de registro.
O quadro de horários dos monitores e estagiários se encontra afixado.
NÃO É PERMITIDA A PRESENÇA EM AULA SEM O USO DO JALECO.
NÃO É PERMITIDO FAZER USO DE QUALQUER TIPO DE ALIMENTO NO LABORATÓRIO.
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AULA 1 – MANUSEIO E UTILIZAÇÃO DO MICROSCÓPIO
Objetivos:
Conhecer o laboratório e normas de utilização.
Conhecer o microscópio de luz.
Familiarizar-se com a utilização do microscópio de Luz.
1. Identificação dos componentes ópticos e mecânicos do microscópio.
Identifique os componentes ópticos e mecânicos do microscópio. Descreva a função de cada um dos componentes.
2 – Manuseio do microscópio óptico
Ligue na tomada 127 V.
Acenda a lâmpada do microscópio, na chave (liga-desliga) à sua esquerda;
Controle a intensidade de luz girando o botão localizado na base do microscópio;
O microscópio deve estar na objetiva de 4x;
Caso não esteja, faça-o, girando o REVÓLVER no qual está localizada. Gire até obter o click;
Coloque a lâmina sobre a platina, fixando-a com a presilha. Certifique-se de que a lâmina está devidamente encaixada entre as duas presilhas e não sobre apenas uma delas;
Utilizando o charriot, posicione o corte histológico sobre o foco de luz;
Olhando nas oculares, ajuste o foco utilizando o parafuso macrométrico (MAIOR) localizado lateralmente ao microscópio. Estes parafusos erguem a platina, focalizando o corte histológico contido na lâmina;
Com o parafuso micrométrico (MENOR), dê o ajuste mais adequado para o melhor foco. Este parafuso está localizado no interior do parafuso macrométrico;
Não force além do limite esta ou qualquer parte o microscópio;
Utilizando o charriot, percorra o campo, enquanto o observa;
Girando novamente o revólver, observe o corte em médio (10x) e depois em grande aumento (40x). A objetiva de 100x deverá ser utilizada em lâminas especiais e com o auxilio do professor e monitor; 
Ao terminar a observação, encaixe a objetiva de menor aumento, retire a lâmina e a guarde-a na caixa e local correspondente;
Volte para a objetiva de 4x, girando novamente o revólver;
Reduza a intensidade de luz girando o botão localizado na base do microscópio
Desligue a lâmpada do microscópio e retire sua tomada do plug, colocando a capa posteriormente.
ATENÇÃO
Não movimente a platina do microscópio com a objetiva de maior aumento encaixada, pois poderá quebrar a lâmina;
Não transporte ou arraste o microscópio, pois este é um equipamento frágil, danificando-se com facilidade;
Mantenha os equipamentos que você está utilizando em boas condições, já que os mesmos estão sob sua responsabilidade;
Mantenha a caixa de lâminas sempre fechada.
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AULA 2 – COMPONENTES CELULARES E MÉTODOS DE ESTUDO
Objetivos
Identificar os principais componentes estruturais de uma célula animal
Identificar em lâminas permanentes estruturas basófilas e acidófilas
1. Observação de células descamadas da mucosa oral
Coloque uma gota de água sobre a lâmina
Com uma espátula de madeira faça uma suave raspagem da mucosa bucal
Coloque o material colhido na gota de água sobre a lâmina
Cubra com a lamínula e observe o material ao microscópio utilizando as objetivas de 3,2X, 10X e 40X. Lembre-se das condições de iluminação adequadas para a observação de material a fresco. Esquematize o material observado na objetiva de 40X indicando núcleo, citoplasma e limite celular. Ao terminar, retorne para a objetiva de 4X e remova a lâmina.
Coloque uma gota de azul de toluidina em uma das arestas da lamínula. Aguarde alguns minutos e observe ao microscópio. Lembre-se das condições de iluminação adequadas para a observação de material corado. Explique quais as dificuldades apresentadas na observação das células antes da coloração. Discuta se o corante utilizado é vital ou supra-vital.
2 – Observação de células em preparação permanente
2.1 – estruturas acidófilas e basófilas
Lâmina 69. Fígado, HE.
Focalize o corte na objetiva de 3,2X, passe para o aumento médio (10X) e corra a lâmina utilizando o charriot. Observe que o fígado tem aspecto de uma esponja e apresenta cavidades de vários tamanhos (figura 366, Khünel, pag 267, 7ª Ed.). As cavidades delgadas são vasos sanguíneos chamados de capilares sinusóides. As cavidades maiores também são vasos sanguíneos. Com a objetiva de 40X (maior aumento) observe:
Núcleo dos hepatócitos – aparecem como estruturas arredondadas que contêm grânulos corados em roxo (figura 1 – prancha 15.4, Gartner e Hiatt, pag 235). Os grânulos são de cromatina (nome que se dá aos cromossomos na interfase). A cromatina se cora em roxo porque sendo constituída de ácido desoxirribonucléico (DNA) tem afinidade pela hematoxilina, um corante básico, azul arroxeado. Nas preparações histológicas os núcleos aparecem sempre corados pelo corante básico – são basófilos.
Nucléolo – no interior do núcleo observe um grão (ou dois) maior que os outros, mais intensamente corado. Ele contém uma grande quantidade de RNA.
Citoplasma – o citoplasma das células contém substâncias ácidas e básicas, e dependendo da predominância de um tipo ou outro, pode ser basófilo ou acidófilo. No caso presente predominam as estruturas básicas, por isso o citoplasma está corado em rosa, pela eosina. Por ser a eosina um corante ácido o citoplasma é, neste caso, considerado acidófilo.
Limite celular – nas células animais o limite celular nem sempre é visível, por isso para delimitar as células usa-se o limite imaginário. No caso dos hepatócitos localize dois núcleos que estejam próximos e divida o citoplasma situado entre eles dois. Este é o limite imaginário.
Outras células – observe a presença de outras células no corte com núcleos em formatos diferentes
Escolha um campo qualquer da lâmina e faça um desenho contendo as estruturas observadas em maior aumento.
Figura 366, Khünel, pag 267, 7ª Ed. Fígado. Azan. 40X. 1. Veia central. 2. Espaço periportal. 
Kühnel, Wolfgang. Citologia, histologia e anatomia microscópica: texto e atlas. 7ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2005.
Figura 1 – prancha 15.4, Gartner e Hiatt, pag 235. Fígado. HE. 540X. LP. Placas hepáticas. H. hepatócitos. Si. Sinusóides. SC. Células de revestimento sinusoidal. 
Gartner, Leslie P. e Hiatt, James L. Atlas de histologia.
Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1993.
Lâmina 33. Gânglio nervoso espinhal, Tricrômico de Gômori
 
O tricrômico de Gomori é muito utilizado para colorações histológicas e contém 3 corantes: a hematoxilina e o 2R, corantes básicos, e o verde luz, um corante ácido. Focalize
 o corte em menor aumento, passe para o médio aumento e procure um campo que contenha células arredondadas e volumosas (figura 673, Khünel, pag 494, 11ª Ed.). Posicione uma célula no centro do campo e passe para o maior aumento. Observe:
Neurônios – células volumosas rodeadas de outras células menores (figura 1, Khünel, pag 3, 7ª Ed.).
Limite celular – não é possível observar o limite celular, pois os neurônios são células com muitos prolongamentos citoplasmáticos. Seu limite pode ser observado acompanhando-se a disposição das células satélites. O núcleo das células satélites são menores que os dos neurônios e não se percebe o citoplasma delas.
Núcleos dos neurônios – esféricos, volumosos e de cromatina descondensada (frouxa) com nucléolo evidente. Os núcleos que têm cromatina espalhada como estes são chamados de vesiculosos. 
Nucléolo – observe dentro do núcleo um grão esférico corado em vermelho pelo cromóforo 2R. O nucléolo contém RNA e proteínas.
Citoplasma – no citoplasma dos neurônios predominam estruturas acidófilas que têm afinidade pelo verde luz. Também aparecem granulações finas, basofílicas, que se coram pela hematoxilina.
Núcleos de outras células – observe que além dos neurônios e anficitos (células satélites) existem espalhados por todo o corte e, principalmente entre as estruturas coradas pelo verde luz, núcleos menores e alongados, de cromatina densa. 
Escolha um campo contendo um neurônio e faça um desenho contendo as estruturas observadas.
Figura 673, Khünel, pag 494, 11ª Ed. Gânglio espinhal. Azan. 80X. 1. Células ganglionares espinhais. 2. Fibras nervosas condutoras de bainhas mielínicas.
Kühnel, Wolfgang. Citologia, histologia e anatomia microscópica: texto e atlas. 11.ed.atual. e ampl.. Porto Alegre: Artmed, 2005.
Figura 1, Khünel, pag 3, 7ª Ed. Células do gânglio espinhal. Azan. 40X. 1. Núcleo com nucléolo evidente. 2. Células satélites. 3. Fibras nervosas. 4. Capilares.
Kühnel, Wolfgang. Citologia, histologia e anatomia microscópica: texto e atlas. 11.ed.atual. e ampl.. Porto Alegre: Artmed, 2005.
2.2 – citoquímica
Lâmina 3 – corte de fígado, coloração histoquímica pelo PAS + HE.
A reação do PAS (periódico ácido de Schiff) é usada para detectar radicais vic-glicol e seus derivados aminados. Estes radicais são encontrados em alguns carboidratos, como o glicogênio, o ácido siálico e as mucinas neutras. Essa reação não é específica para uma única substância, mas para um grupo. Para determinar qual substância entre essas é responsável pela positividade do PAS usa-se contra provas. 
A coloração pelo PAS se baseia nas seguintes reações:
1. preparo do reativo de Schiff
fuccina básica (cor bonina) + ácido sulfuroso → reativo de Schiff (incolor)
O reativo de Schiff volta a apresentar cor bonina quando reage com aldeídos.
2. Oxidação dos radicais vic-glicol para liberação dos aldeídos
A reação do ácido periódico seletivamente oxida os resíduos de glicose, produzindo aldeídos que reagem com o reagente de Schiff e produz uma cor púrpura-magenta. 
	
	+  HIO4  =  
	
	1-2-glycol
	 
	Aldehyde
	
	+  HIO4  =  
	
	1-amino-2-hydroxy
	 
	Aldehyde
3. Reversão da cor do reativo de Schiff
Nos locais do corte onde foi liberado o aldeído – onde existam grupos vic-glicol- o reativo de Schiff volta a sua cor normal (bonina). Diz-se então que estes locais são PAS+.
Focalize o corte em pequeno aumento e corra o campo. Passe para o médio aumento e escolha o campo que lhe parece mais corado e conservado. Centralize uma célula e passe para o maior aumento. Observe:
As fileiras de hepatócitos separadas por vasos sanguíneos (compare com a lâmina 69).
Os núcleos dos hepatócitos corados em roxo pela hematoxilina (coloração histológica).
Os grãs PAS+ no citoplasma das células (figura 53, Sobotta, pag 32, 6ª Ed.). 
Figura 53, Sobotta, pag 32, 6ª Ed. Hepatócitos (rato). PAS-hemalúmen. 600X. Evidenciação seletiva de glicogênio intracelular corado em vermelho, sob a forma de partículas granulares até pequenos blocos.
Welsch, U (Ed). Sobotta – Atlas de histologia. 6a Ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2003.
Glicogênio – ME.
Observe a eletromicrografia número 1, de um hepatócito, aumentado 50.000X. Na região do citoplasma, onde estão presentes algumas mitocôndrias, estão presentes aglomerados de glicogênio, formados por grânulos eletrodensos que assumem, muitas vezes, disposição típica em roseta.
ME1. Hepatócito. Glicogênio. 50.000X
Célula – ME.
Observe o aspecto de uma célula típica ao microscópio eletrônico (figura 1 – prancha 1.5, Gartner e Hiatt, pag 12). O citoplasma é delimitado por uma membrana celular (cabeças de seta) bastante evidente, sobretudo nos pontos onde se aproxima da membrana de células vizinhas. As mitocôndrias (m) são facilmente reconhecidas por causa de suas cristas (setas) típicas. O complexo de Golgi (GA), formado por várias camadas de membranas achatadas, é evidente e localizado próximo ao núcleo (N). Observa-se também a presença de reticulo endoplasmático rugoso (rER) e a presença de produtos de secreção (asteriscos) no citoplasma. O núcleo (N) é limitado por envoltório nuclear (NE), constituído por duas membranas, um externa, com ribossomos aderidos, e outra interna. O nucléolo (n), sítio da síntese dos ribossomo, é evidente. 
Figura 1 – prancha 1.5, Gartner e Hiatt, pag 12. Hipófise de rato. 8.936X. 
Gartner, Leslie P. e Hiatt, James L. Atlas de histologia. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1993.
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AULA 3 – NÚCLEO INTERFÁSICO
Objetivos
Identificar, em eletromicrografias, núcleo denso e vesiculoso, nucléolo, envelope nuclear, poros nucleares.
Identificar, em lâmina permanente, núcleo interfásico e nucléolo
Relacionar o aspecto morfológico do núcleo à atividade celular
Associar a forma do núcleo com a forma da célula
Reveja as lâminas 69 e 33 (aula 2). Observe o formato do núcleo (dos hepatócitos na lâmina 69 e dos neurônios na lâmina 33), a presença dos grânulos de cromatina no interior do núcleo e a ocorrência do nucléolo. Agora observe a lâmina 62 (você estudará esta lâmina em maior detalhe em outra aula). Compare o formato dos núcleos das células nas lâminas 69 e 33 com aqueles observados na lâmina 62. Discuta porque nestes diferentes tecidos os núcleos assumem formas distintas.
Volte para a lâmina 33 e localize uma região de coloração predominantemente verde. Passe para o maior aumento e observe a presença de núcleos fusiformes (núcleos de fibroblastos). Observe que diferente dos núcleos observados anteriormente a cromatina se encontra condensada e por isto o núcleo adquire uma coloração forte e homogênea – característica de um núcleo denso. Relacione o diferente aspecto dos núcleos – denso ou vesiculoso – com a atividade celular.
Núcleo vesiculoso. ME
Observe o aspecto do núcleo vesiculoso ao microscópio eletrônico (ME2). O nucléolo é visível – distinguido por seu aspecto granular devido a presença de grânulos de ribonucleoproteínas – e a cromatina tem aspecto eletrolúcido, predominantemente, uma vez que encontra-se frouxa (ME3). Grânulos de cromatina são mais evidentes na periferia do núcleo, onde esta se prende ao envelope nuclear. Observe o envelope nuclear – formado por duas unidades de membrana – que é regularmente interrompido por poros nucleares (setas) (ME3). 
ME2. Núcleo vesiculoso. 50.000X
ME3. Núcleo vesiculoso. Nucléolo, envelope nuclear, poros nucleares. 50.000X
Núcleo denso. ME
Observe agora o aspecto do núcleo denso ao microscópio eletrônico (ME4) e compare com o núcleo vesiculoso, apontando as diferenças. 
ME4. Núcleo denso.
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