Aula 03 - Estrutura dos Ácidos Nucléicos

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Estrutura dos Ácidos Nucléicos
Aspectos Moleculares 
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 Enfoques Conceituais
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1866: Gregor Mendel
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1869 → Johann Friedrich Miescher
# Buscava determinar os componentes químicos do núcleo celular. 
# Usava os glóbulos brancos contidos no pus para suas pesquisas (células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma).
# Descobriu a presença de um composto de natureza ácida desconhecido até o momento (rico em fósforo e em nitrogênio, desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina - enzima proteolítica)) → nucleína 
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1880 → Albrecht Kossel 
# Demonstrou que a nucleína continha bases nitrogenadas em sua estrutura. 
1889 → Richard Altmann
# Obteve nucleína com alto grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e dando-lhe o nome de ácido nucléico. 
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns
Redescoberta de Mendel
Leis da Hereditariedade
Leis de Mendel
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1928: Frederick Griffith:Transformação
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1944: Avery, MacLeod e MacCarty: Princípio transformante
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1953: Alfred Hershey e Martha Chase
DNA  32P
Proteína  35S
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1953: James Watson e Francis Crick
Maurice Wilkins e Rosalind Franklin
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DNA → INTRODUÇÃO
 Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicação é fundamental.
 Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas.
 Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de DNA.
 DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que controlam a expressão gênica
ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA
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DNA → INTRODUÇÃO
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DNA → INTRODUÇÃO
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99%
1%
GENOMA HUMANO
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GENOMA HUMANO
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DEFINIÇÃO DE GENE
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Pentose (Açúcar)
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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PURINAS
Bicíclicas
PIRIMIDINAS
Monocíclicas
Adenina = Timina Guanina  Citosina
 Uracil
Purina Adenina Guanina
Pirimidina Citosina Uracil Timina 
Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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PIRIMIDINAS
Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas
Uracil
Timina
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Posições dos Átomos
Grupamento Fosfato
Bases Nitrogenadas
Pentose
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Nucleotídeo
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Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Bases Nitrogenadas
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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5’AACGTTGCTATCGT3’
5’  3’
Base
Base
Base
Sentido da Fita de DNA
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH2)
Chargaff
Relação Molar (1949)
AT = CG (?)
(A+G) = (T+C)
Bases Nitrogenadas
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Ligações Fosfodiéster
Ligação (-) Glicosídica (Glicosílica)
Ligações Importantes
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
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Ligações Covalentes
Sítios Hidrofóbicos
Sítios Hidrofílicos
Forças de Van der Walls
Pontes de Hidrogênio
Interações Iônicas (Mg+2)
Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade
DUPLA-HÉLICE DO DNA
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DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
 Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação.
 DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA.
 RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA.
 Esses processos podem ser observados in vitro
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DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através dos seguintes mecanismos:
→ aumento de temperatura
→ titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis aromáticos)
→ agentes desnaturantes (formamida)
# Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice (levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares).
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Efeito Hipercrômico
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de absorbância de luz ultravioleta (UV).
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DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases.
Adenina = Timina Guanina  Citosina
 Uracil
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
 Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é muito estável.
 Para que estes processos ocorram há a necessidade da participação de enzimas especializadas (DNA-helicases e SSBs)
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Rompimento das Pontes de Hidrogênio
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
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DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
 Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas, o processo pode ser revertido.
 Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente resfriada, as fitas complementares reassociam-se.
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
 No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta.
 Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação
# Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua renaturação.
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DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
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DUPLA-HÉLICE DO DNA
As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno:
→ cavidade maior
→ cavidade menor
# Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente.
# Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas) podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da dupla-hélice.
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Antiparalelas
DUPLA-HÉLICE DO DNA
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0.34 nm
Cavidade Menor
Cavidade Maior
Volta
Cavidades Maior e Menor
DUPLA-HÉLICE DO DNA
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Cavidades Maior e Menor
DUPLA-HÉLICE DO DNA
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Cavidades Maior e Menor
DUPLA-HÉLICE DO DNA
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TIPOS DE DNA
O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua composição de bases e do meio em que se encontra
→ DNA A 
→ DNA B
→ DNA Z
Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de dupla-hélice clássica)
Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal no meio em que se encontra o Tipo A.
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TIPOS DE DNA
Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA Tipo B ou Tipo A.
# Fatores que estabilizam sua formação:
→ metilação ou bromação de bases
→ estresse torcional
→ ligação de proteínas específicas ao DNA
 Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do DNA com proteínas.
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TIPOS DE DNA
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 DNA B DNA A DNA Z
TIPOS DE DNA
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TIPOS DE DNA
 DNA B DNA A DNA Z
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Conformação anti e syn
C2’-endo
C3’-endo
DNA B
DNA A
DNA Z
Etanol 75%
 [Sal]
Dupla RNA
Metilação ou Bromação
 Umidade Relativa (92%)
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
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Principais características dos DNAs A, B e Z
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
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RNA x DNA
H
H
H
H
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RNA x DNA
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RNA mensageiro (mRNA)
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RNA transportador (tRNA)
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RNA ribossomal (rRNA)
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OUTROS RNAs
hnRNA
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RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi)
Premio Nobel de Medicina 2006
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O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear).
# Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente, formam-se as chamadas estruturas circulares.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Linear x Circular
Plamídeos e Vírus
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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 Além da estrutura secundária da dupla-hélice, o DNA assume uma conformação tridimensional supertorcida.
# A dupla-hélice enrola-se
sob si mesma (extremamente importante nos processos de replicação, transcrição, recombinação e expressão gênica).
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Supertorções
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Estrutura Supertorcida, Suprerenrolada ou Super-hélice
A
B
C
Grau de superenrolamento crescente
A: Relaxada 
B: Superenrolamentos parciais 
C: Totalmente Superenrolado
Topoisômeros
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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 Plectonêmico → DNA em solução.
 Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os nucleossomos.
# O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas criciformes, triplex ou DNA Tipo Z.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Tipos de Superenrolamentos
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Tipos de Superenrolamentos
Plectonêmico
Toroidal
Solução
Histonas
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que diferem apenas na sua topologia.
Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos.
A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras.
Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas.
TOPOISOMERASES
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Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA
Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice
Participam de importantes etapas nos processos de replicação, transcrição e recombinação 
# o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas de DNA pode ser medido de diferentes maneiras.
TOPOISOMERASES
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Topoisomerase do tipo I
Topo I: Monômero de 100 kDa (+ e –)
Mutação no Gene topA  Inviável
Topo III: Monômero de 74 kDa (+)
Mutação no Gene topB  Viável
Relaxamento de Superenrolamento
 ATP
Ligação e 
Desnaturação
Ligação 
Fosfotirosina
Restauração
do DNA
E. coli
TOPOISOMERASES
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Topoisomerase do tipo II
Topo II  Tetrâmero 400 kDa
DNA-Girase  Sub A e B
Adiciona Supertorções –
Gene gyrA e gene gyrB
Topo IV  Catenadas
Antibióticos e Antitumorais
E. coli
105 a 140 pb
Central: 20 pb (AT)
Lateral: Rica em GC
5’-Tyr(122)A
TOPOISOMERASES
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Métodos de aferição do grau de superenrolamento
Eletroforese em gel de agarose
→ separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação (funções diretas do superenrolamento)
→ o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu tamanho e forma)
# Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou supertorcida.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Métodos de aferição do grau de superenrolamento
Gel Agarose
Velocidade de Sedimentação
Microscopia Eletrônica
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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Tratamento com Topoisomerase
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ácidos Nucléicos  maiores representantes do genótipo (DNA)
Proteínas  maiores representantes do fenótipo
DNA  Envolvido com todo metabolismo do organismo
Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas  Informações
DNA  Moléculas principais
RNA  Moléculas intermediárias
Proteína  Resultado final da informação
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