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* Estrutura dos Ácidos Nucléicos Aspectos Moleculares & Enfoques Conceituais * * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1866: Gregor Mendel * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1869 → Johann Friedrich Miescher # Buscava determinar os componentes químicos do núcleo celular. # Usava os glóbulos brancos contidos no pus para suas pesquisas (células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma). # Descobriu a presença de um composto de natureza ácida desconhecido até o momento (rico em fósforo e em nitrogênio, desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina - enzima proteolítica)) → nucleína * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1880 → Albrecht Kossel # Demonstrou que a nucleína continha bases nitrogenadas em sua estrutura. 1889 → Richard Altmann # Obteve nucleína com alto grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e dando-lhe o nome de ácido nucléico. * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns Redescoberta de Mendel Leis da Hereditariedade Leis de Mendel * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1928: Frederick Griffith:Transformação * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1944: Avery, MacLeod e MacCarty: Princípio transformante * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1953: Alfred Hershey e Martha Chase DNA 32P Proteína 35S * HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 1953: James Watson e Francis Crick Maurice Wilkins e Rosalind Franklin * * DNA → INTRODUÇÃO Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicação é fundamental. Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas. Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de DNA. DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que controlam a expressão gênica ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA * DNA → INTRODUÇÃO * DNA → INTRODUÇÃO * 99% 1% GENOMA HUMANO * GENOMA HUMANO * DEFINIÇÃO DE GENE * Pentose (Açúcar) ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * PURINAS Bicíclicas PIRIMIDINAS Monocíclicas Adenina = Timina Guanina Citosina Uracil Purina Adenina Guanina Pirimidina Citosina Uracil Timina Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * PIRIMIDINAS Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas Uracil Timina ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Posições dos Átomos Grupamento Fosfato Bases Nitrogenadas Pentose ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA Nucleotídeo * Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Bases Nitrogenadas ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * 5’AACGTTGCTATCGT3’ 5’ 3’ Base Base Base Sentido da Fita de DNA ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH2) Chargaff Relação Molar (1949) AT = CG (?) (A+G) = (T+C) Bases Nitrogenadas ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Ligações Fosfodiéster Ligação (-) Glicosídica (Glicosílica) Ligações Importantes ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA * Ligações Covalentes Sítios Hidrofóbicos Sítios Hidrofílicos Forças de Van der Walls Pontes de Hidrogênio Interações Iônicas (Mg+2) Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade DUPLA-HÉLICE DO DNA * DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação. DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA. RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA. Esses processos podem ser observados in vitro * DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através dos seguintes mecanismos: → aumento de temperatura → titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis aromáticos) → agentes desnaturantes (formamida) # Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice (levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares). * Efeito Hipercrômico DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de absorbância de luz ultravioleta (UV). * DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases. Adenina = Timina Guanina Citosina Uracil Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%) Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é muito estável. Para que estes processos ocorram há a necessidade da participação de enzimas especializadas (DNA-helicases e SSBs) * Rompimento das Pontes de Hidrogênio Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%) T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO * DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas, o processo pode ser revertido. Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente resfriada, as fitas complementares reassociam-se. T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta. Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação # Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua renaturação. * DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO * DUPLA-HÉLICE DO DNA As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno: → cavidade maior → cavidade menor # Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente. # Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas) podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da dupla-hélice. * Antiparalelas DUPLA-HÉLICE DO DNA * 0.34 nm Cavidade Menor Cavidade Maior Volta Cavidades Maior e Menor DUPLA-HÉLICE DO DNA * Cavidades Maior e Menor DUPLA-HÉLICE DO DNA * Cavidades Maior e Menor DUPLA-HÉLICE DO DNA * TIPOS DE DNA O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua composição de bases e do meio em que se encontra → DNA A → DNA B → DNA Z Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de dupla-hélice clássica) Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal no meio em que se encontra o Tipo A. * TIPOS DE DNA Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA Tipo B ou Tipo A. # Fatores que estabilizam sua formação: → metilação ou bromação de bases → estresse torcional → ligação de proteínas específicas ao DNA Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do DNA com proteínas. * TIPOS DE DNA * DNA B DNA A DNA Z TIPOS DE DNA * TIPOS DE DNA DNA B DNA A DNA Z * Conformação anti e syn C2’-endo C3’-endo DNA B DNA A DNA Z Etanol 75% [Sal] Dupla RNA Metilação ou Bromação Umidade Relativa (92%) DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO * Principais características dos DNAs A, B e Z DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO * RNA x DNA H H H H * RNA x DNA * RNA mensageiro (mRNA) * RNA transportador (tRNA) * RNA ribossomal (rRNA) * OUTROS RNAs hnRNA * RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi) Premio Nobel de Medicina 2006 * O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear). # Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente, formam-se as chamadas estruturas circulares. FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Linear x Circular Plamídeos e Vírus FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Além da estrutura secundária da dupla-hélice, o DNA assume uma conformação tridimensional supertorcida. # A dupla-hélice enrola-se sob si mesma (extremamente importante nos processos de replicação, transcrição, recombinação e expressão gênica). FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Supertorções FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Estrutura Supertorcida, Suprerenrolada ou Super-hélice A B C Grau de superenrolamento crescente A: Relaxada B: Superenrolamentos parciais C: Totalmente Superenrolado Topoisômeros FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Plectonêmico → DNA em solução. Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os nucleossomos. # O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas criciformes, triplex ou DNA Tipo Z. FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO Tipos de Superenrolamentos * Tipos de Superenrolamentos Plectonêmico Toroidal Solução Histonas FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que diferem apenas na sua topologia. Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos. A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras. Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas. TOPOISOMERASES * Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice Participam de importantes etapas nos processos de replicação, transcrição e recombinação # o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas de DNA pode ser medido de diferentes maneiras. TOPOISOMERASES * Topoisomerase do tipo I Topo I: Monômero de 100 kDa (+ e –) Mutação no Gene topA Inviável Topo III: Monômero de 74 kDa (+) Mutação no Gene topB Viável Relaxamento de Superenrolamento ATP Ligação e Desnaturação Ligação Fosfotirosina Restauração do DNA E. coli TOPOISOMERASES * Topoisomerase do tipo II Topo II Tetrâmero 400 kDa DNA-Girase Sub A e B Adiciona Supertorções – Gene gyrA e gene gyrB Topo IV Catenadas Antibióticos e Antitumorais E. coli 105 a 140 pb Central: 20 pb (AT) Lateral: Rica em GC 5’-Tyr(122)A TOPOISOMERASES * Métodos de aferição do grau de superenrolamento Eletroforese em gel de agarose → separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação (funções diretas do superenrolamento) → o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu tamanho e forma) # Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou supertorcida. FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Métodos de aferição do grau de superenrolamento Gel Agarose Velocidade de Sedimentação Microscopia Eletrônica FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * Tratamento com Topoisomerase FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO * CONSIDERAÇÕES FINAIS Ácidos Nucléicos maiores representantes do genótipo (DNA) Proteínas maiores representantes do fenótipo DNA Envolvido com todo metabolismo do organismo Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas Informações DNA Moléculas principais RNA Moléculas intermediárias Proteína Resultado final da informação * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
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