BIOLOGIA MOLECULAR - PCR E ELETROFORESE

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Engenharia Genética e a Tecnologia do DNA Recombinante: 
PCR (Polymerase Chain Reaction )
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
O método de PCR é usado habitualmente: 
 No diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas; 
 Na identificação de "impressões digitais" genéticas;
 Na construção de árvores filogenéticas; 
 No seqüênciamento de genomas; 
 Na expressão de genes em sistemas recombinantes; 
 No estudo de genética molecular; 
 Em testes de paternidade; 
 Na medicina forense. 
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
3 – Extensão: a DNA-Polimerase produz a fita complementar do DNA molde, a uma temperatura de aproximadamente 72ºC.
O processo de PCR ocorre em três etapas.
 
1 – Desnaturação: o DNA que se quer amplificar é aquecido a 94-96°C a fim separar as dupla-fitas. 
2 – Anelamento: a temperatura é diminuída, a 60ºC, assim, os primers podem unir-se às fitas-simples do DNA.
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Ciclagem
Gráfico da Cinética do PCR.
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Problemas:
■ DNA-polimerase da bactéria Escherichia coli → Desnaturação em Altas Temperaturas.
■ Ineficiência do processo: Altas demandas de DNA-poli. → Vários banhos-maria de temperaturas diferentes → atenção contínua durante todo o processo.
Soluções:
DNA-polimerase termoestável foi obtida do Thermus aquaticus → Taq-polimerase.
Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automático.
Yellowstone 
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Componentes
Toda PCR requer:
■ Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA
■ Desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
■ DNA polimerase termoestável
■ Tampão para manter o pH (TBE)
	
■ Amostra de DNA
Tampão da Taq:
■ toda DNA pol. requer cátion divalente, usualmente MgCl - cofator
	
 ■ (KCl) como tampão.
	
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Resultado:
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Posição da amplificação
Animação
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Cinética do PCR
As causas do platô são várias:
■ Perda da atividade da enzima;
■ Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA;
■ Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos;
■ Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase;
■ Acúmulo de pirofosfato (PiPi);
■ Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas também foram se acumulando
Etc…
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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PCR - Polymerase Chain Reaction 
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Tipos de PCRs:
■ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
■ RAPD (RANDOM AMPLIFIED
POLYMORPHIC DNA)
■ Nested PCR
■ Real time PCR
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Eletroforese em Gel
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
■ Utilizada, normalmente, para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.	
■ Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. 
■ As moléculas são separadas devido ao tamanho. O formato das moléculas também podem influir, 
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Eletroforese em Gel
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
■ Introduzida em 1939 por Tiselius e Kabat com o objetivo de separar partículas orgânicas.
■ O DNA da célula deve ser extraído para a utilização na eletroforese. 
■ Em princípio uma molécula com carga desloca-se em um campo magnético em uma velocidade proporcional à sua densidade de carga total, tamanho e forma.
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Eletroforese em Gel
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	Utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados por 5 a 10 cm. Num compartimento o eletrodo com fio preto determina o pólo negativo, e no outro compartimento o eletrodo com fio vermelho é o pólo positivo. 
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Eletroforese em Gel
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MONTANDO A ELETROFORESE
	1 - Montar a cuba;		
	2 - Adicionar o gel, previamente preparado;
	3 - Colocar a solução tampão com pH definido;
	4 - Adicionar as amostras a serem separadas:
		DNA
		Azul de bromofenol
	O azul-de-bromofenol - acusa sua posição por sua banda azul e adverte sobre o término da corrida antes de chegar à extremidade do gel. Também auxilia na sedimentação das amostras nos poços. 
	5 - Ligar a cuba.	
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Eletroforese em Gel
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Eletroforese em Gel
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	As bandas em um gel podem ser visualizadas por cátions aromáticos planares como:
 íon etídeo
 proflavina 
 laranja de acridina
	Ligam-se ao DNA de dupla hélice por intercalação. 
	
	Quantidades pequenas, como 50 ng de DNA, podem ser detectados em gel contendo brometo de etídeo (EtBr).
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Eletroforese em Gel
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Análise eletroforética em gel de agarose
Polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente composto de D-Galactose e L-Galactose. 
Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA.
Capaz de separar fragmentos com uma ótima resolução. 
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Eletroforese em Gel
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Fatores que influenciam a migração em gel de agarose:
■ Concentração da agarose no gel; 
■ O tamanho dos fragmentos de DNA (fragmento menor é mais rápido); 
■ A conformação do DNA, (circular fechado, mais rápido; circular aberto, mais lento; linear, intermediário); 
■ A corrente aplicada maior voltagem resulta em migração mais rápida;
■ A direção do campo elétrico, o DNA migra em direção ao ânodo (pólo de carga positiva) devido aos grupos fosfatos de carga negativa; 
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Eletroforese em Gel
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Eletrofrese capilar 
	O gel e a amostra estão dentro de um capilar, e a amostra é detectada automaticamente por um detector. Essa é a eletroforese atualmente utilizada em seqüênciadores de DNA.
Eletroforese em gel de poliacrilamida 
	Mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". 
Eletroforese desnaturante 
	Normalmente feita em gel de agarose, incluindo um agente desnaturante (normalmente uréia), o que ajuda a melhorar a separação entre as moléculas que apresentam diferenciação em
suas estruturas secundárias.
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Eletroforese em Gel
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Eletroforese bi-dimensional
	1 - Focalização Isoelétrica (IEF)
 	2 - Eletroforese desnaturante desnaturante em gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
	
Eletroforese em campo pulsado
	Moléculas de DNA maiores de 10 megabases são capazes de re-orientar e mover diferencialmente através dos poros do gel de agarose
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Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Biotecnologia: o DNA em foco
Dúvidas?