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Microbiologia II Professor(a) autor(a)/conteudista Adryella de Paula Ferreira Luz É vedada, terminantemente, a cópia do material didático sob qualquer forma, o seu fornecimento para fotocópia ou gravação, para alunos ou terceiros, bem como o seu fornecimento para divulgação em locais públicos, telessalas ou qualquer outra forma de divulgação pública, sob pena de responsabilização civil e criminal. Sumário Procedimentos clínicos ...............................................................................4 Introdução ....................................................................................................... 4 1 Processamento de alguns materiais clínicos ............................................... 4 1.1 Urocultura .............................................................................................. 4 1.2 Hemocultura ........................................................................................ 10 1.3 Cultura de ponta de cateter .................................................................. 13 1.4 Cultura de trato respiratório inferior .................................................... 15 1.5 Materiais do trato respiratório superior ............................................... 19 1.6 Amostras do trato genital .................................................................... 20 1.7 Líquidos orgânicos ............................................................................... 21 Identificação dos microrganismos .............................................................24 2 Identificação dos microrganismos ............................................................. 24 2.1 Identificação dos cocos Gram-positivos ............................................. 24 2.2 Identificação dos bacilos Gram-negativos .......................................... 29 2.3 Teste de sensibilidade .......................................................................... 35 Conclusão...................................................................................................... 35 Glossário ....................................................................................................... 36 Referências bibliográficas ............................................................................. 36 4/36 Procedimentos clínicos Introdução Vídeo: Apresentação https://player.vimeo.com/video/369821663 Neste material abordaremos alguns procedimentos de coleta e cultura segundo diferentes situações e os casos de infecções associadas a elas. Serão elencados: • os tipos de amostras e os principais cuidados e observações na sua coleta; • a forma de realizar o transporte adequadamente; • os riscos de contaminação e como evitá-los; • a identificação dos microrganismos e algumas de suas características, além das patologias a que estão relacionados. 1 Processamento de alguns materiais clínicos 1.1 Urocultura Vídeo: Urocultura https://player.vimeo.com/video/369821690 É indicada a realização de cultura de amostras de urina quando existe uma suspeita de infecção do trato urinário (ITU), para o controle de tratamento ou em pacientes assintomáticos com maior risco de infec- ção, como aqueles com a imunidade debilitada. As infecções do trato urinário podem acometer indivíduos de todas as idades, independentemente do seu estado de saúde. Entretanto, esse tipo de infecção é mais comum entre as mulheres devido às características anatômicas do sistema urinário feminino. https://player.vimeo.com/video/369821663 https://player.vimeo.com/video/369821690 5/36 A maioria das infecções é caracterizada pela presença de um número elevado de leucócitos na amos- tra (piúria), sendo importante correlacionar os resultados da cultura com a urinálise. Vale ressaltar que há situações em que as infecções urinárias podem apresentar contagem normal ou um pouco elevada de leucócitos. Figura 1 – Infecção do trato urinário Fonte: Suttha Burawonk/Shutterstock Os principais patógenos causadores de ITU são: • Bacilos Gram-negativos: • Escherichia coli (principal patógeno, representando até 70% das ITUs). • Klebsiella pneumoniae. • Proteus spp. • Enterobacter spp. • Cocos Gram-positivos: • Staphylococcus saprophyticus. • Enterococcus spp. As infecções do trato urinário são classificadas em: bacteriúria assintomática, cistite, pielonefrite e ITU complicada e não complicada: • Bacteriúria assintomática: é a presença de bactérias no trato urinário, sem sintomatologia, sendo importante em gestantes e crianças com refluxo vesicouretral. • Cistite: é a infecção da bexiga, em que o sintoma principal é a disúria. • Pielonefrite: infecção nos rins e na pélvis, normalmente associada a infecção sistêmica e febre. • ITU complicada: infecção que acomete um indivíduo que tenha alguma anormalidade no sistema urinário. 6/36 1.1.1 Coleta A coleta do material é a garantia de um bom exame de urocultura e, para isso, alguns cuidados precisam ser tomados. É necessário orientar corretamente o paciente/cliente quanto ao procedimento da coleta. O ideal é fazer essas orientações por escrito ou com desenhos e gravuras que fiquem disponíveis para o momento da coleta. Apesar de a urina ser considerada um material biológico estéril, ela pode ser facilmente contaminada no momento da coleta com a microbiota normal de períneo, vagina, próstata ou uretra. A coleta de urina deve ser feita em frasco de boca larga estéril, com tampa de rosca, sempre que possível antes da antibioticoterapia. Figura 2 – Frasco de boca larga estéril com amostra Fonte: Shidlovski/Shutterstock O ideal é que o paciente retenha a urina de duas a três horas. Em algumas situações, por exemplo, para confirmar uma contagem baixa da cultura, pode ser necessária retenção urinária de até quatro horas. É importante dizer ao paciente para não ingerir líquido em excesso, pois isso fará com que a amostra fique diluída, comprometendo o resultado da cultura. CURIOSIDADE A urina humana apresenta diversas substâncias descartadas pelo corpo mas que têm outras propriedades e são estudadas de diferentes formas. Conheça um pouco sobre essas aplicações: http://www.bbc.com/portuguese/internacional-36492193. http://www.bbc.com/portuguese/internacional-36492193 7/36 Urina de paciente com cateterismo vesical Esse tipo de amostra não é ideal para cul- tura. Quando existe a solicitação, deve ser realizada desinfecção da cânula com álcool 70%. Após a desinfecção, pinçar a cânula do coletor e, com uma seringa e agulha esté- reis, puncioná-la e retirar até 10 mL de urina. Em seguida, colocar em frasco esté- ril apropriado. Urina coletada por sonda de alívio É um procedimento feito por técnica asséptica. É recomendado desprezar o fluxo inicial (15 mL a 30 mL) e, em seguida, coletar para cultura. A decisão de passar sonda de alívio é do médico, e o procedimento deve ser realizado pela equipe de enfermagem. Urina de porção suprapúbica Esse tipo de coleta de amostras é pouco utilizado. Normalmente, é feito em crianças com menos de dois anos de idade. A amostra é coletada com agulha e seringa diretamente por punção da bexiga, e sua 1.1.2 Tipos de amostras Urina jato médio É a amostra mais comum para realização de urocultura. Deve ser realizada higiene na região genital com água e sabão ou clorexidina aquosa a 0,2%. Desprezar o primeiro jato e colher o jato médio em frasco estéril apropriado, sem interromper a micção até a metade do frasco. O restante da micção deve ser desprezado. Amostra de urina de qualquer jato Amostra obtida com auxílio de saco coletor em crianças ou idosos. É necessário fazer higiene antes de colocar o saco coletor. Este deve ser trocado com intervalo entre 45 minutos e 1 hora, sempre fazendo a higiene antes da troca. É fundamental evitar contaminação fecal. O laboratório deve receber o próprio saco coletor. Figura 3 – Saco coletor de urina Fonte: Natalia Kopyltsova/istock. 8/36 indicação é para suspeita de infecção por microrganismos anaeróbios.Por isso, ela deve ser semeada em meios de cultura ricos, e não em meio específico para urina. Como esse material é coletado diretamente na bexiga, qualquer crescimento bacteriano deve ser consi- derado após incubação de 48 horas. Urina de primeiro jato Esse tipo de amostra é indicado para suspeita de infecção uretral quando a secreção uretral é escassa. Após a higiene prévia com água e sabonete ou clorexidina aquosa a 0,2%, coletar os primeiros 10 mL de urina. 1.1.3 Transporte da amostra As amostras de urina podem ser transportadas em temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) ou refrigeradas (2 °C a 8 °C). Quando transportadas em temperatura ambiente, devem ser processadas em até duas horas após a coleta. Quando transportadas refrigeradas, podem ser processadas em até 24 horas após a coleta. 1.1.4 Procedimento da cultura A semeadura da amostra de urina pode ser realizada por metodologia quantitativa, feita com alça calibrada de platina ou de plástico, ou semiquantitativa, utilizando o sistema de laminocultivo. A alça calibrada descartável de 0,01 (10 µL) ou 0,001 (1 µL) está disponível comercialmente e é estéril. Técnica de semeadura quantitativa • Homogeneizar a urina sem centrifugar. • Imergir a alça calibrada e retirá-la. • Semear em placa MacConkey, CLED ou meio cromogênico. • Incubar em estufa de 35 ± 2 °C por 18 a 24 horas. • Quando, na primeira leitura, não for observado crescimento bacteriano e, no exame de urina, esti- ver alterada a contagem de leucócitos e a presença de bactérias, incubar durante mais 18 a 24 horas na estufa. Interpretação do resultado Quando a amostra for semeada com a alça calibrada de 1 µL, temos a diluição 1:1.000, então será mul- tiplicado o número de colônias por 1.000. 9/36 Exemplo: 50 colônias na placa = contagem de 50 mil unidades formadoras de colônias em mililitros (UFC/mL). Quando a amostra foi semeada com a alça calibrada de 10 µL, temos a diluição 1:100, então será multi- plicado o número de colônias por 100. Exemplo: 50 colônias na placa = contagem de 5 mil UFC/mL. Nas figuras a seguir, vemos fotos que demonstram todos os passos da semeadura quantitativa de amos- tra de urina. Figura 4 – Amostra de urina Fonte: arquivo pessoal. 10/36 1.2 Hemocultura Vídeo: Hemocultura https://player.vimeo.com/video/369821727 A hemocultura é a cultura realizada para bactérias e/ou fungos em amostra de sangue. Geralmente, a indicação acontece quando há suspeita de infecção da corrente sanguínea (ICS). A bacteremia é definida como a presença de microrganismos na corrente sanguínea e pode ser classifi- cada como primária ou secundária: • Bacteremia primária: entrada direta de microrganismos na corrente sanguínea por meio de agu- lhas, infusões contaminadas, cateter etc. • Bacteremia secundária: drenagem dos microrganismos a partir de foco infeccioso primário. Conceitualmente, as bacteremias ainda podem ser classificadas como transitórias, intermitentes, con- tínuas e de escape. • Transitória: rápida, com duração de alguns minutos, e mais comum, ocorre após manipulação de algum tecido infectado (furúnculos ou abscessos) ou de procedimento cirúrgico com tecidos contaminados (odontológicos, endoscopia). • Intermitente: quando se manifesta em intervalos variáveis de tempo e com o mesmo microrga- nismo. Geralmente, ocorre em processos infecciosos relacionados a abscessos intra-abdomi- nais, pélvicos, hepáticos e prostáticos, entre outros. • Contínua: é característica da endocardite infecciosa e outras infecções intravasculares. • Escape: ocorre em um ou mais dias após o início de uma antibioticoterapia supostamente ade- quada. Pode estar relacionada a bactérias multirresistentes. Os microrganismos isolados com mais frequência nas amostras de hemocultura são: • Staphylococcus coagulase-negativo (SCN). • S. aureus. • Enterococcus spp. • Streptococcus spp. • K. pneumoniae. • E. coli. • P. aeruginosa. • Acinetobacter spp. • Candida spp. https://player.vimeo.com/video/369821727 11/36 1.2.1 Número de amostras e intervalo entre as coletas Uma amostra é obtida de uma punção e pode ser inoculada em um ou mais frascos de hemocultura. Deve-se sempre verificar a quantidade de sangue a ser inoculada no frasco, conforme o fabricante. Geralmente, duas coletas de hemocultura são suficientes, mas, se existir uma solicitação médica de uma ter- ceira amostra, essa punção poderá ser realizada após 30 minutos a 1 hora ou em 24 a 48 horas, dependendo da urgência, do estado clínico do paciente e/ou da necessidade de introdução de antibioticoterapia imediata. 1.2.2 Volume de sangue O volume de sangue coletado é uma das variáveis mais importantes que interferem diretamente na sen- sibilidade da metodologia utilizada e na positividade da hemocultura. A proporção recomendada entre o volume de sangue e o meio de cultivo, para os sistemas convencio- nais, é de 1:5 a 1:10. No caso dos sistemas automatizados, é necessário verificar a quantidade exigida pelo fabricante. 1.2.3 Tipos de frascos Tanto para a metodologia manual quanto para a automatizada, temos os meios de cultura para aeróbios e anaeróbios. Geralmente são meios enriquecidos que devem favorecer o crescimento dos microrganis- mos, inclusive os considerados fastidiosos. Figura 5 – Frascos de hemocultura do sistema Bactec® da BD Fonte: http://everesttradelink.com.np/product/automated-blood-culture-system/. Figura 6 – Frascos de hemocultura para metodologia manual Fonte: https://www.interjet.com.br/ produto/hemocultura. 1.2.4 Coleta e transporte As amostras que são coletadas sem antissepsia adequada podem levar ao isolamento de microrganis- mos contaminantes não relacionados ao processo infeccioso. Portanto, a coleta adequada da amostra http://everesttradelink.com.np/product/automated-blood-culture-system/ https://www.interjet.com.br/produto/hemocultura https://www.interjet.com.br/produto/hemocultura 12/36 de hemocultura é essencial para obter resultados confiáveis. É recomendado que a coleta seja feita antes da antibioticoterapia, mas, quando isso não é possível, é importante coletar a amostra antes da próxima dose do antimicrobiano. Em relação ao transporte, quando os frascos colhidos forem de equipamentos automatizados, devem ser enviados ao laboratório em temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) até 12 horas após a coleta. No caso de frascos de metodologia manual, eles podem permanecer em estufa até serem enviados ao laboratório. 1.2.5 Infecção de corrente sanguínea relacionada ao cateter (ICS-RC) É necessário ressaltar a importância de relacionar a infecção da corrente sanguínea ao cateter quando o paciente faz uso desse dispositivo. Veremos mais à frente a cultura de ponta de cateter e sua importân- cia nos diagnósticos de infecção de corrente sanguínea relacionada ao cateter (ICS-RC). Figura 7 – Técnica de processamento de hemoculturas pelo método manual Frasco de hemocultura Semear em AS e fazer Gram* Semear em AS e fazer Gram* Liberar segativo desprezar frasco Incubar a 30°C por ±10 dias Semear em CHOC Suspeito positivo Semear em A5 e fazer Gram* Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Negativo*** Positivo** Realizar identificação e antibiograma Emitir resultado parcial Negativo Fungos? Após 24 horas Após 48 horas Observar diariamente**** Incubar 35 ± 2°C em CO2 Incubar 35 ± 2°C em CO2 Incubar 35 ± 2°C 7º dia Fonte: adaptado de Oplustil et al. (2010). 13/36 1.3 Cultura de ponta de cateter Vídeo: Ponta de cateter https://player.vimeo.com/video/369821753 As infecções relacionadas ao cateter normalmente apresentam, no local de inserção, sinais inflama- tórios como eritema, pus e enduração, entre outros. Uma das situações de suspeita dessa infecção é quando o paciente apresenta febre e ausência de outro foco infeccioso. Essas infecções precisam ser diagnosticadas com rapidez, pois são muito importantes clinicamente, por serem muito comuns nesses pacientes. A metodologia semiquantitativa, descritapor Maki et al., é a mais utilizada em laboratórios clínicos para determinar a relação entre colonização do cateter e infecção. Nela, um resultado com crescimento ≥ 15 UFC/mL de um microrganismo deve ser considerado significativo de infecção. Além de cultura semiquantitativa do cateter, pode ser utilizada uma metodologia alternativa de coleta pareada de amostras de sangue de igual volume, via cateter e via periférica, quando a metodologia for de um sistema automatizado. Nesse caso, quando a amostra coletada via cateter duas horas antes da amostra do sangue periférico com o mesmo microrganismo for positiva, supõe-se que a ICS seja rela- cionada ao cateter. Tipos de cateter em que é possível a realização de cultura: • Central. • Periférico. • Arterial, Swan-Ganz. • Port-a-cath. • Broviac. • Triplo-lúmen. • Hickman. Os principais microrganismos isolados em cultura de cateter são: • SCN. • Staphylococcus aureus. • Acinetobacter spp. • Pseudomonas aeruginosa. • Enterobactérias. https://player.vimeo.com/video/369821753 14/36 • Outros bacilos Gram-negativos. • Corynebacterium spp. • Candida spp. 1.3.1 Procedimento da cultura Para a semeadura, é necessário algo para cortar o cateter (bisturi ou tesoura, estéreis), caso ele venha com mais de 5 cm de comprimento. • Retirar do frasco ou tubo o pedaço de cateter. • Colocar na superfície do meio ágar sangue. • Com o auxílio de uma pinça estéril, rolar o cateter por toda a superfície do meio. • É importante observar que o cateter esteja realmente rolando no ágar e não sendo esfregado. Seguem figuras com todo o procedimento da semeadura da ponta de cateter. Figura 8 – Procedimento de semeadura Fonte: arquivo pessoal. 1.3.2 Interpretação do resultado da cultura O resultado da cultura é obtido pela contagem de colônias, sendo considerada a seguinte classificação: • Infecção: ≥ 15 UFC/placa. • Contaminação: 25 leucócitos/campo > 10 células epiteliais/campo e 10 células/campo Aspirado traqueal 10 células/campo Ausência de bactéria em 20 campos (aumento de 100 vezes) Fonte: adaptado de Oplustil et al. (2010). Lavado brônquico A amostra é obtida do brônquio principal ou dos brônquios direito e esquerdo. Esse procedimento con- siste em injetar um volume de NaCl a 0,85% estéril pelo broncoscópio e lavar os alvéolos. Em seguida, o material é coletado em frasco estéril. Quando coletadas amostras dos lados esquerdo e direito, devem ser encaminhadas em frascos diferentes. Lavado broncoalveolar (LBA) As amostras obtidas com esse procedimento vêm diretamente dos bronquíolos e dos alvéolos pulmona- res. O procedimento consiste em injetar um volume de NaCl a 0,85% estéril pelo broncoscópio e lavar os alvéolos. Em seguida, o material é coletado em frasco estéril. Várias lavagens podem ser feitas no mesmo alvéolo ou em alvéolos diferentes. Nesse caso, as amostras devem ser coletadas em frascos distintos. Esse procedimento deve ser realizado antes que sejam feitas biópsias ou escovados, devido a eventual sangramento, e é realizado por equipe médica especializada. Escovado brônquico protegido O material normalmente é a própria escova, colocada em um tubo contendo 1 mL de NaCl. Esse material é mais indicado para pesquisa de vírus e citologia. Biópsia transbrônquica Esse material é obtido durante a broncoscopia. A biópsia coletada deve ser colocada em frasco com solu- ção fisiológica estéril. Podem também ser coletados biópsia de pulmão, aspirado pulmonar e líquido pleural. 18/36 1.4.2 Procedimentos da cultura Cultura de escarro e aspirado quantitativa • Diluir 1:2 com agente mucolítico (1 mL da amostra + 1 mL do mucolítico), homogeneizar e deixar 15 minutos em temperatura ambiente. • Diluir 0,1 mL em 9,9 mL de solução fisiológica estéril. • Semear 0,01 mL nas placas. • Diluição final 1:20.000. Cultura de lavado brônquico, LBA e escovado (quantitativa) • Homogeneizar a amostra. • Diluir 0,1 mL em 0,9 mL de solução fisiológica estéril. • Semear 0,01 mL da amostra nas placas. 1.4.3 Interpretação dos resultados das culturas Cultura de escarro Microbiota oral normal geralmente presente nas culturas: • Neisseria spp. • Streptococcus grupo viridans. • Corynebacterium spp. • SCN. Cultura de lavado brônquico, lavado broncoalveolar e aspiradotraqueal Algumas culturas podem apresentar crescimento de patógenos da microbiota oral normal, por isso é importante a quantificação nelas para valorizar ou não o crescimento desses microrganismos. Os valores de referência para a avaliação das amostras do trato respiratório inferior são: • Escovado brônquico – crescimento ≥ 10³ UFC/mL. • Lavado broncoalveolar – crescimento ≥ 104 UFC/mL. • Aspirado traqueal – crescimento ≥ 106 UFC/mL. 19/36 Os microrganismos mais isolados nessas amostras são: • Faringite, tonsilite: Streptococcus pyogenes β-hemolítico dos grupos C e G. • Sinusite aguda: Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes. • Sinusite crônica: os mesmos da aguda, bacilos Gram-negativos, Pseudomonas aeruginosa, anaeróbios e fungos. 1.5.1 Processamento das amostras do trato respiratório superior Esses materiais podem ser coletados em swabs de meio de transporte ou em fras- cos estéreis. Em ambos os casos, devem ser semeados em meios de cultura ricos em nutrientes, pois a maioria dos micror- ganismos isolados nessas culturas são fastidiosos, ou seja, bactérias mais exi- gentes em relação aos nutrientes para o seu metabolismo e crescimento. 1.5 Materiais do trato respiratório superior Vídeo: Trato respiratório superior https://player.vimeo.com/video/369821826 Os exames mais solicitados do trato respiratório superior são cultura de orofaringe, tonsila (amígdala) e faringe. Existem outras amostras que podem também ser solicitadas para a realização de cultura, como de seios maxilares para diagnóstico de sinusite, mucosa oral para o diagnóstico de candidíase oral e secreção nasofaríngea, entre outros. Figura 11 – Sistema respiratório Fonte: Alila Medical Media/Shutterstock https://player.vimeo.com/video/369821826 20/36 1.6 Amostras do trato genital Vídeo: Trato genital https://player.vimeo.com/video/369821864 As doenças infecciosas que acometem o trato genital masculino e feminino podem ser de origem bac- teriana, viral, parasitária ou fúngica. Grande parte dessas infecções pode ser assintomática ou causar sintomas muito discretos, que podem passar despercebidos pelo paciente. Quando existe um desequilíbrio hormonal e do pH vaginal, alguns microrganismos da microbiota normal podem tornar-se patógenos, como Gardnerella vaginalis e Candida spp. Na uretra feminina, encontramos uma microbiota normal com vários microrganismos: • Enterobactérias (principalmente Escherichia coli). • Lactobacilos. • Streptococcus spp. • Enterococcus spp. • Neisseria spp. (não patogênica). • SCN. • Anaeróbios. A microbiota masculina é composta por microrganismos da pele: • SCN. • Streptococcus do grupo viridans. • Corynebacterium spp. • Micrococcus spp. As infecções do trato genital feminino mais comuns são vulvovaginite, vaginose bacteriana, cervicite, doença inflamatória pélvica e lesões genitais. No homem, as infecções mais comuns são uretrite, epididimite, prostatite e lesões genitais. 1.6.1 Processamento das amostras de secreções do trato genital – Coleta e transporte São vários os materiais clínicos do trato genital feminino e do masculino que podem ser submetidos a exames microbiológicos. Geralmente, as amostras são coletadas em swab com meio de transporte apropriado. Além dos swabs, normalmente são coletadas lâminas para microscopia, por facilitar a libe- ração parcial do exame. A Gardnerella vaginalis, por exemplo, apresenta uma característica marcante quando observada em coloração de Gram, que são as clue cells, demonstradas na figura a seguir. https://player.vimeo.com/video/369821864 21/36 Figura 12 – Clue cells características de infecção por Gardnerella vaginalis Fonte: https://www.labmedica.com/pathology/articles/294781613/potential-microbial- markers-identified-for-cervical-pre-cancer-progression.html. 1.7 Líquidos orgânicos Vídeo: Líquidos orgânicos https://player.vimeo.com/video/369821904 Qualquer região ou fluido estéril do corpo pode ser infectado por bactérias, fungos, vírus ou parasitas. Ape- sar de as amostras serem obtidas de diferentes áreas do corpo humano, são tratadas de forma semelhante. 1.7.1 Líquido pleural É um material colhido por procedimento invasivo, retirado entre o pulmão e a pleura. Deve ser colocado em frasco estéril e encaminhado ao laboratório em até duas horas após a coleta. Os patógenos mais frequentes são: • Streptococcus pneumoniae. • Bacilos Gram-negativos. • Legionella spp. 1.7.2 Líquido peritoneal A cavidade abdominal engloba os órgãos da região abdominal e pélvica. Os patógenos mais frequentes na peritonite primária são: https://www.labmedica.com/pathology/articles/294781613/potential-microbial-markers-identified-for-cervical-pre-cancer-progression.html https://www.labmedica.com/pathology/articles/294781613/potential-microbial-markers-identified-for-cervical-pre-cancer-progression.html https://player.vimeo.com/video/369821904 22/36 • Em crianças: • Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, enterobactérias, SCN. • Em adultos: • Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes. Os patógenos mais frequentes na peritonite secundária são: • Anaeróbios (Bacteroides fragilis), Escherichia coli, Enterococcus spp., Streptococcus spp., Neisseria gonorrhoeae. 1.7.3 Líquido ascítico Ascite é o aumento do volume de líquidos na cavidade abdominal. O líquido é obtido por punção, deve ser colocado em frasco estéril e encaminhado em temperatura ambiente até duas horas após a coleta. 1.7.4 Líquido de diálise O líquido de diálise peritoneal é obtido após a introdução de uma quantidade de solução hidroelétrica na cavidade abdominal peritoneal. Esse procedimento é comum em pacientes com insuficiência renal e substitui o rim na sua função de troca de íons e sais na remoção de substâncias tóxicas. Quando existe suspeita de infecção, o líquido removido pode ser encaminhado para cultura em um frasco estéril em temperatura ambiente até duas horas após a coleta. A amostra também pode ser encaminhada na própria bolsa de diálise. Nesse caso, é importante homo- geneizar várias vezes o líquido e fazer assepsia com álcool 70% no local onde será aspirado para o pro- cedimento da cultura. Os principais patógenos isolados normalmente são: • SCN. • Staphylococcus aureus. • Enterococcus spp. • Streptococcus spp. • Pseudomonas aeruginosa. • Acinetobacter spp. • Enterobactérias. 1.7.5 Líquido sinovial As articulações podem apresentar sinais de processos inflamatórios, com ou sem infecção. O material obtido é colhido por punção da articulação, sendo enviado na própria seringa em temperatura ambiente em até duas horas após a coleta. Deve-se lembrar que o material enviado em seringa não deve ser enca- minhado com agulha, e sim com a ponta da seringa bloqueada. 23/36 1.7.7 Medula óssea Em certas situações, a coleta de medula óssea é muito importante para o diagnóstico de algumas infecções fúngicas (blastomicose e histoplasmose) e por micobactérias. O mais recomendado é fazer a coleta em frascos de hemocultura com volume de 1 mL a 5 mL. O material deve ser encaminhado ao laboratório em temperatura ambiente em no máximo 12 horas para ser processado. Os principais patógenos isolados são: • Staphylococcus aureus. • Neisseria gonorrhoeae. • Haemophilus influenzae. • Streptococcus pyogenes. Quando o paciente faz uso de próteses, os microrganismos geralmente isolados são: • SCN. • Propionibacterium spp. • Corynebacterium spp. 1.7.6 Líquido cefalorraquidiano A meningite aguda é uma das infecções mais comuns do sistema nervoso central (SNC) e representa impor- tante urgência médica. Ela pode ser causada por bacté- rias ou vírus. Em razão da gravidade dessas infecções, o laboratório deve estar preparado para realizar o diagnóstico com rapidez e precisão. Geralmente, a con- centração de microrganismos é baixa (amostra. A amostra deve ser colhida em tubo estéril e encaminhada ao laboratório em temperatura ambiente o mais rápido possível. Dependendo do patógeno, a demora de mais de uma hora pode prejudicar o exame, pois bactérias como Neisseria meningitidis ou Haemophilus influenzae tendem a morrer mais facilmente. Figura 13 – Bactéria da meningite Fonte: Ezume Images/Shutterstock 24/36 Identificação dos microrganismos 2 Identificação dos microrganismos Vídeo: Identificação de microrganismos https://player.vimeo.com/video/369821944 2.1 Identificação dos cocos Gram-positivos Os cocos compõem um grupo de grande importância clínica e são responsáveis por inúmeras e variadas infecções e síndromes. Os cocos Gram-positivos de maior importância clínica pertencem a uma de duas famílias, Micrococcaceae ou Streptococcaceae, sendo as bactérias não esporuladas as que mais resistem no ambiente. 2.1.1 Família Micrococcaceae Staphylococcus spp. As espécies clinicamente mais importantes são: • S. aureus. • S. epidermidis. • S. saprophyticus. • S. warneri. • S. hominis. • S. haemolyticus. • S. capitis. • S. caprae. • S. lugdunensis. Entre essas espécies, as mais isoladas em materiais clínicos são S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus (em urina): https://player.vimeo.com/video/369821944 25/36 S. aureus É a espécie mais importante, sendo responsá- vel pelo segundo maior número de infecções em seres humanos. Está presente no trato res- piratório superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da população em geral, e assim permanece sem causar doença em condi- ções normais. A enzima extracelular mais importante é a coa- gulase, exclusividade da espécie, por isso é um critério na sua identificação. O nome aureus significa “dourado” em latim e se deve à coloração característica da sua colônia. Figura 14 – Colônias de S. aureus em ágar sangue Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pure_Isolated_ colonies_of_Staphylococcus_aureus_on_Blood_agar.jpg. S. epidermidis É a segunda espécie mais importante do gênero. Faz parte da microbiota normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores. É uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus, não apresenta a produção de coagulase, e algumas cepas apresentam produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas. Essa espécie tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents etc.). Figura 15 – Colônias de S. epidermidis em ágar sangue Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:S._epidermis_ culture.JPG. S. saprophyticcus É de interesse clínico, pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulhe- res, podendo chegar a causar cistite, uretrite, pielonefrite e, em casos extremos, bacteremia. 2.1.2 Família Streptococcaceae β-hemolíticos do grupo A – S. pyogenes O reservatório natural é o homem, e a transmissão se dá por via respiratória, sendo a faringite a infecção mais frequente causada por esse microrganismo. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pure_Isolated_colonies_of_Staphylococcus_aureus_on_Blood_agar.jpg https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pure_Isolated_colonies_of_Staphylococcus_aureus_on_Blood_agar.jpg https://commons.wikimedia.org/wiki/File:S._epidermis_culture.JPG https://commons.wikimedia.org/wiki/File:S._epidermis_culture.JPG 26/36 Figura 16 – Colônias de S. pyogenes em ágar sangue Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Streptococcus_pyogenes_(Lancefield_Group_A)_on_Columbia_Horse_Blood_Agar.jpg. β-hemolíticos do grupo B – S. agalactiae Faz parte da microbiota do trato gastrointestinal. Em mulheres, coloniza vagina e reto, por isso é a prin- cipal causa de doença nos períodos neonatal e perinatal; pode acontecer transmissão vertical (útero ou durante o parto) ou nosocomial após o nascimento. β-hemolíticos do grupo D • S. bovis Associado a infecções humanas e animais. • S. equinus Encontrado predominantemente em cavalos, raro agente causador de bacteremia e endocardite no homem. S. pneumoniae É o principal causador de pneumonia bacteriana comunitária, podendo também causar meningite bac- teriana em adultos. Geralmente, as infecções graves ocorrem em crianças com menos de dois anos; em adultos, no final da meia idade, e em idosos. O seu principal fator de virulência é a cápsula de polissaca- rídeos. O material capsular evita que o microrganismo seja fagocitado e morto pelas células fagocitárias do hospedeiro. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Streptococcus_pyogenes_(Lancefield_Group_A)_on_Columbia_Horse_Blood_Agar.jpg 27/36 Figura 17 – Colônias de S. pneumoniae em ágar sangue Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Streptococcus_pneumoniae_on_Columbia_Horse_Blood_Agar.jpg. Streptococcus do grupo viridans Esse grupo inclui várias espécies de estreptococos α-hemolíticos e não hemolíticos: • S. sanguinis. • S. oralis. • S. gordonii. • S. mitis. • S. mutans. • S. salivarius. Podem causar endocardite bacteriana aguda e complicações de abscessos paravalvulares e glomerulonefrite. Enterococcus spp. Fazem parte da microbiota de trato gastrointestinal, trato geniturinário e cavidade oral, além de esta- rem presentes em solo, água, vegetais e alimentos. Sobrevivem em ambientes contaminados, sendo a segunda causa mais importante de infecções hospitalares nos Estados Unidos. A sua importância deve-se ao fato de poderem apresentar resistência a vários antimicrobianos, inclusive à vancomicina. As espécies mais importantes são: • E. faecalis. • E. faecium. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Streptococcus_pneumoniae_on_Columbia_Horse_Blood_Agar.jpg 28/36 Figura 18 – Colônias de Enterococcus faecalis em ágar sangue Fonte: http://www.bacteriainphotos.com/bacteria%20under%20microscope/bacterial%20colonies/ enterococcus%20larger/enterococcus%20faecalis%20on%20agar.jpg. Figura 19 – Esquema para identificação dos cocos Gram-positivos Cocos gram-positivos Catalase Estafilococo Coagulase em tubo Aglutimação látex Optoquina 14mm DNase Estreptococos Beta hemólise Sem hemolise S. aureus S. lugdunensis S. saprophyticus Streptococcus grupo viridans Streptococcus pneumoniae Outros beta-hemolíticos Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae SCN PYR PYR CAMP rápido SCN Isolado de urina Isolado de urina Alfa-hemólise Ornitina (+) Ornitina (-) Novobiocina R Aglutinar*** S. aureus SCN (+) (+) (–) (–) (–) (–) (+) (–) (+) (–) (+) (+) (+) (–)(+) (–) Não Não Sim Sim Fonte: Oplustil et al. (2010). http://www.bacteriainphotos.com/bacteria%20under%20microscope/bacterial%20colonies/enterococcus%20larger/enterococcus%20faecalis%20on%20agar.jpg http://www.bacteriainphotos.com/bacteria%20under%20microscope/bacterial%20colonies/enterococcus%20larger/enterococcus%20faecalis%20on%20agar.jpg 29/36 ACONTECEU Cientistas criaram uma “arena” para bactérias, onde diferentes concentrações de antibióticos aumen- tavam das bordas para o centro. Depois de dias, as bactérias venceram o antibiótico gradativamente, demonstrando diferentes evoluções e adaptações. Leia o artigo em: https://www.publico.pt/ciencia/noti- cia/cavalgada-microbiologica-mostra-bacterias-a-adaptaremse-aos-antibioticos-1743580. 2.2 Identificação dos bacilos Gram-negativos 2.2.1 Enterobactérias As enterobactérias são fermentadoras de glicose, formando um grupo muito extenso de microrganismos. Fazem parte da nossa microbiota do trato gastrointestinal e podem causar vários tipos de infecções. Na rotina laboratorial, o início da identificação ocorre com o crescimento em ágar sangue ou MacConkey. As enterobactérias mais frequentemente isoladas em amostras clínicas são: Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Serratia spp. e Providencia spp. Escherichia coli Podem causar váriostipos de infecções, desde as do trato urinário até bactere- mia. Existem quatro tipos – os quais só conseguimos identificar por meio de tes- tes sorológicos – que causam infecção gastrointestinal: • E. coli enteropatogênica (EPEC). • E. coli enterotoxigênica (ETEC). • E. coli enteroinvasora (EIEC). • E. coli entero-hemorrágica (EHEC). Figura 20 – Colônias de Escherichia coli em ágar EMB Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:E_coli_on_EMB_plate.jpg. https://www.publico.pt/ciencia/noticia/cavalgada-microbiologica-mostra-bacterias-a-adaptaremse-aos-antibioticos-1743580 https://www.publico.pt/ciencia/noticia/cavalgada-microbiologica-mostra-bacterias-a-adaptaremse-aos-antibioticos-1743580 https://commons.wikimedia.org/wiki/File:E_coli_on_EMB_plate.jpg 30/36 Figura 21 – Colônias de Escherichia coli em ágar MacConkey Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Escherichia_coli_growth_on_MacConkey_agar.jpg. Qualquer espécie de Salmonella pode causar gastroenterites, bacteremia e septicemia, bem como febre entérica. Além disso, a Salmonella typhi é a causadora da febre tifoide. No gênero Salmonella, existe uma grande quantidade de sorotipos, que não são mais considerados como espécies; sua identificação sorológica completa e detalhada é uma tarefa restrita aos denominados laboratórios de referência. Figura 22 – Colônias de Salmonella spp. Fonte: https://www.istockphoto.com/br/foto/col%C3%B4nias-bacterianas-samonella-spp- crescimento-em-m%C3%ADdia-seletiva-de-%C3%A1gar-gm614305660-106248209. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Escherichia_coli_growth_on_MacConkey_agar.jpg https://www.istockphoto.com/br/foto/col%C3%B4nias-bacterianas-samonella-spp-crescimento-em-m%C3%ADdia-seletiva-de-%C3%A1gar-gm614305660-106248209 https://www.istockphoto.com/br/foto/col%C3%B4nias-bacterianas-samonella-spp-crescimento-em-m%C3%ADdia-seletiva-de-%C3%A1gar-gm614305660-106248209 31/36 Shigella spp. Causa infecção gastrointestinal, podendo chegar a infecções mais graves. As espécies são: • Shigella sonnei. • Shigella dysenteriae. • Shigella boydii. • Shigella flexneri. Klebsiella spp. As espécies mais frequentemente isoladas em amostras clínicas são K. oxytoca e K. pneumoniae, sendo esta de maior importância clínica. A K. pneumoniae é muito comum no ambiente hospitalar, podendo causar pneumonias, infecções do trato urinário, endocardites, infecções pós-cirúrgicas e bacteremias. Atualmente, é um grande pro- blema nos hospitais brasileiros quando é produtora de KPC, uma enzima capaz de inativar alguns antimicrobianos. Figura 23 – Colônias de Klebsiella pneumoniae em ágar MacConkey Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Klebsiella_growth_on_MacConkey_agar.jpg. Citrobacter spp. Pode causar pielonefrites, meningites no recém-nascido, abscesso cerebral, endocardite e bacteremias em indivíduos com a imunidade comprometida. Há relatos de diarreias causadas por C. freundii (raro) e C. koseri em alguns casos de meningites em neonatos. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Klebsiella_growth_on_MacConkey_agar.jpg 32/36 Proteus spp. Existem duas espécies: P. mirabilis e P. vulgaris. São móveis, com colônias irregulares em meio sólido e com característica de formar véu. A espécie de maior importância é o P. mirabilis, que é agente de infecções urinárias (principalmente em meninos) e de feridas, comum em infecções comunitárias. Em infecção urinária, por hidrolisarem a ureia, formam amônia, alcalinizando a urina, o que favorecerá a pro- dução de cálculos renais. Serratia spp. Produz pigmento vermelho em meios sólidos, e a espé- cie de maior importância clínica é a S. marcescens. É um patógeno que causa desde infecções urinárias, feridas cirúrgicas até pneumonias, sendo isolado em infecções hospitalares. Diferencia-se das demais enterobactérias pela presença de três enzimas: DNase, lipase e gelatinase. Enterobacter spp. Existem 11 espécies, sendo os principais patógenos o E. aerogenes e o E. cloacae. Podem causar infecções oportunistas, uriná- rias e respiratórias. Isoladas geralmente de pacientes hospitalizados. 2.2.2 Provas bioquímicas para enterobactérias O meio de Rugai modifi cado (IAL) consiste em um tubo que contém substratos para visualização de nove provas bioquímicas, em que a leitura é baseada na reação química dos substratos, conforme demonstrado na fi gura a seguir. Figura 24 – Colônias de Serratia marcescens Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/ File:Serratia_marcescens_01.jpg. Figura 25 – Esquema de leitura do Rugai modifi cado LISINA MOTILIDADE L-TRIPTOFANO SACAROSE ÁPICE INDOL FASE SUPERIOR Composição do meio IAL/RUGAI VASCAR FASE INFERIOR BASEGÁS SULFÍDRICO (H2S) GÁS GLICOSE UREIA Fonte: https://4.bp.blogspot.com/-ZVxJ7HoJ0e0/WVUHAP8s0EI/ AAAAAAAAGGs/3XjG7RYriQI6SlzqM5JYw1W5oE-mRep2ACLcBGAs/ s1600/Meio_IAL_Rugai.png. 33/36 Figura 26 – Tabela de interpretação dos resultados do Rugai Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/5304080/17/images/50/Leitura+do+meio+de+Rugai.jpg. 2.2.3 Bacilos Gram-negativos não fermentadores Esses microrganismos não utilizam carboidratos como fonte de energia ou os degradam por meio de vias que não a fermentação. Dessa maneira, é necessário utilizar uma série bioquímica apropriada para a identificação deles. Entre os bacilos Gram-negativos mais importantes clinicamente, podemos citar: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia e complexo Burkholderia cepacia. Os mais frequentemente envolvidos com infecções hospitalares são P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Pseudomonas aeruginosa É uma das bactérias patogênicas mais importantes clinicamente em infecções hospitalares. Suas colô- nias são redondas e lisas, de coloração esverdeada e fluorescente em razão da substância pioverdina. Ela pode apresentar crescimento entre 37 °C e 42 °C, o que ajuda a diferenciá-la de outras espécies de Pseudomonas. http://slideplayer.com.br/slide/5304080/17/images/50/Leitura+do+meio+de+Rugai.jpg 34/36 Figura 27 – Colônias de Pseudomonas aeruginosa Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pseudomonas_aeruginosa_culture.JPG. Acinetobacter spp. São cocobacilos imóveis. Devido à grande resistência aos antimicrobianos, trata-se de um patógeno muito importante nas infecções hospitalares. Figura 28 – Colônias de Acinetobacter baumannii em ágar MacConkey Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Acinetobacter_growth_on_MacConkey_agar.jpg. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pseudomonas_aeruginosa_culture.JPG https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Acinetobacter_growth_on_MacConkey_agar.jpg 35/36 2.3 Teste de sensibilidade Vídeo: Antiobiograma https://player.vimeo.com/video/369821990 Após realização da cultura, quando há crescimento de microrganismos patogênicos, além da identifica- ção deste(s) microrganismo(s), é necessário realizarmos o teste de sensibilidade. 2.3.1 Disco-difusão Existem alguns métodos para realização do teste de sensibilidade. O mais utilizado nos laboratórios de análises clínicas no Brasil é o método de disco-difusão em ágar, que foi descrito por Bauer e Kirby em 1966. Neste método são utilizados discos de papel-filtro impregnados com antibacterianos em uma dose padronizada que são colocados sobre uma placa de ágar Mueller-Hinton, previamente semeada pela bactéria inoculada na cultura através de uma suspensão. Esta placa ficará incubada de 18 a 24 horas e em seguida será feita a leitura dos halos de inibição. SAIBA MAIS Seguem alguns sites importantes para consulta relacionados com o tema da Microbiologia: • Museu de Microbiologia: https://butantan.gov.br/atracoes/museu-de-microbiologia. • Manuais de Microbiologia da Anvisa: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/ publicacoes/servicosdesaude/manuais/manuais-de-microbiologia-clinica. • Revista da Sociedade Brasileira de Microbiologia: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_ serial&pid=0001-3714&lng=en&nrm=iso. Conclusão Tratamosde alguns dos principais tipos de procedimentos de culturas, indicando suas respectivas prá- ticas e as preocupações que devem ser levadas em conta em sua coleta, transporte e no procedimento de cultura, garantindo a precisão, segurança e confiabilidade da análise. Por fim, vimos as característi- cas desses microrganismos e as especificidades de suas culturas, seu aspecto visual e as indicações necessárias para sua identificação. https://player.vimeo.com/video/369821990 https://butantan.gov.br/atracoes/museu-de-microbiologia https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/publicacoes/servicosdesaude/manuais/manuais-de-microbiologia-clinica https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/publicacoes/servicosdesaude/manuais/manuais-de-microbiologia-clinica 36/36 SAIBA MAIS O Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo tem um glossário de bactérias com importância médica. Confira: https://microbiologia.icb.usp.br/cultura-e-extensao/textos-de-divulgacao/ bacteriologia/bacteriologia-medica/glossario-de-bacterias-com-importancia-medica/. Glossário Alcalinizar Transformar em alcalino, fazer uma substância tornar-se base, isto é, tornar não ácida, aumentando seu pH. Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Alcalinizante. Disúria Refere-se à dificuldade para urinar. Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Dis%C3%BAria. Etiologia Estudo de determinada causa de um fenômeno, fato, ou objeto específico. Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/ Etiologia. Homogeneizar Tornar homogêneo, misturar diferentes substâncias ou elementos para que se tornem uma solução de aspecto uniforme, fazer um todo de mesma natureza e concentração. Referências bibliográficas KONEMAN, E. W. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014. OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. São Paulo: Sarvier, 2010. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. São Paulo: Atheneu, 2008. https://microbiologia.icb.usp.br/cultura-e-extensao/textos-de-divulgacao/bacteriologia/bacteriologia-medica/glossario-de-bacterias-com-importancia-medica/ https://microbiologia.icb.usp.br/cultura-e-extensao/textos-de-divulgacao/bacteriologia/bacteriologia-medica/glossario-de-bacterias-com-importancia-medica/ https://pt.wikipedia.org/wiki/Alcalinizante https://pt.wikipedia.org/wiki/Dis%C3%BAria https://pt.wikipedia.org/wiki/Etiologia https://pt.wikipedia.org/wiki/Etiologia Procedimentos clínicos Introdução 1 Processamento de alguns materiais clínicos 1.1 Urocultura 1.2 Hemocultura 1.3 Cultura de ponta de cateter 1.4 Cultura de trato respiratório inferior 1.5 Materiais do trato respiratório superior 1.6 Amostras do trato genital 1.7 Líquidos orgânicos Identificação dos microrganismos 2 Identificação dos microrganismos 2.1 Identificação dos cocos Gram-positivos 2.2 Identificação dos bacilos Gram-negativos 2.3 Teste de sensibilidade Conclusão Glossário Referências bibliográficas _Hlk494091451