Produção in vitro de Embriões Bovinos

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Produção in vitro de Embriões Bovinos
CONCEITO / DEFINIÇÃO:
A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica que envolve os processos de maturação oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial (cultivo) em laboratório. E posterior transferência desses embriões. 
Também denominada FIV (Fertilização in vitro)
BIOTÉCNICAS DA REPRODUÇÃO:
ClonagemTransgeniaPIVTEIA (+ usada): ordem crescente de utilização.
HISTÓRICO:
1959 - Primeiro sucesso em coelhos (nascimento);
1968 - FIV em camundongos;
1978 - Louise Brown (primeiro “bebê de proveta”);
1981 - Primeiro bezerro produzido in vitro;
1994 - Primeiro bezerro produzido in vitro no Brasil.
VANTAGENS / APLICAÇÕES:
Maior número de descendentes (1,5 bezerro / semana);
Maior aproveitamento das fêmeas (+ novas, + velhas e em gestação); Em gestação se consegue coletar oócito até 3-4 meses de gestação, período no qual o útero ainda não desceu para a cavidade abdominal.
Suporte para pesquisa básica (capacitação espermática, maturação oocitária, desenvolvimento embrionário) e pesquisa aplicada (criopreservação).
Base para produção de animais transgênicos e clonados.
Utilizações de touros diferentes para uma mesma doadora.
Doadoras TE que não respondem à superovulação;
Problemas reprodutivos adquiridos (aderência).
Animais acidentados.
DESVANTAGENS / LIMITAÇÕES:
Custo inicial para construção da infraestrutura (laboratório + condições para aspiração folicular);
Tempo consumido para estabelecimento da rotina de produção (treinamento técnico e funcionalidade do laboratório);
Inconsistência dos resultados (taxas e qualidade dos embriões);
Problemas com a congelação convencional (baixas taxas de prenhez).
ESTRUTURA LABORATORIAL:
Mais complexa e cara em relação a TE;
Muito mais equipamentos (fluxo laminarsuga ar para evitar a entrada de bactérias; incubadoras de CO2 (mimetiza o útero da vaca); centrífuga; balança analítica, microscópio, freezer, geladeira; sistema de purificação de água; autoclave etc);
Maior rigor em relação à higiene (pelos menos 2 ambientes: preparo de meios e outro para manipulação e cultivo dos gametas e embriões);
Área do laboratório afastada do curral e controlar o acesso de pessoas.
PRINCIPAIS ETAPAS:
Colheita dos oócitos; 
Maturação in vitro (MIV);
Fecundação in vitro (FIV);
Cultivo in vitro (CIV); 
Transferência ou criopreservação.
ORIGEM DOS OÓCITOS:
OVÁRIOS COLHIDOS EM ABATEDOUROS X PUNÇÃO FOLICULAR IN VIVO (OPU)
ABATEDOURO:
Vantagens e desvantagens:
Maior número de oócitos (10 oócitos/ovário);
Colheita simples e barata;
Oócitos de pior qualidade (sazonalidade);
Genética desconhecida;
Propósito científico.
PUNÇÃO FOLICULAR IN VIVO (OPU):
Vantagens e desvantagens:
Menor número de oócitos;
Colheita mais laboriosa e cara (ultra-som);
Oócitos de melhor qualidade;
Genética conhecida (valor comercial);
PROPÓSITO COMERCIAL.
ABATEDOURO:
Retirada dos ovários logo após o abate;
Ovários lavados solução salina a 30°C;
Transportados em solução salina + antibióticos a 30°C;
Tempo máximo abate - laboratório: 8 h;
Laboratório: verificar a temperatura, realizar lavagem dos ovários e aspiração dos folículos com tamanho entre 2 - 8 mm (seringa + agulha ou bomba de vácuo).
OS: deixar o tubo decantando, pois 
vem líquido 
antral
 junto na aspiração e as células do 
cumulus
 
oophorus
 e o 
oócito
. ASPIRAÇÃO:
 
PUNÇÃO FOLICULAR IN VIVO (OPU):
Materiais: 
Ultra-som; 
Guia de aspiração;
Bomba a vácuo. 
Higienizar a vulva fazer uma epidural localizar ovário na mão Introduzir a guia de aspiraçãoguia até o fundo do saco vaginalencostar o ovário no saco vaginalintroduzir a agulha furando o saco vaginal, e o ovário.
NO LABORATÓRIO: 
SEDIMENTAÇÃO DOS OÓCITOS: 
Decantação do aspirado folicular por 10 minutos (em tubos).
MATURAÇÃO IN VITRO:
Seleção dos oócitos para MIV (auxílio de lupa - 20x):
Avaliação das células do cumulus oophorus e do citoplasma do oócito:
 
COMPLEXO CUMULUS-OÓCITO:
 
QUALIDADE DOS OÓCITOS:
 
Oócitos qualidade II e III			 Oócito degenerado (Grau IV)
24 horas no meio de maturação (TCM199 + Soro Fetal
Bovino + FSH+ LH + estradiol) em incubadora de CO2 à
39°C e alta umidade.
Depois
Antes
 
 
 
OBS: Oócito maturado: células do cumulus estão expandidas e formação de corpúsculo porlar!!!
Prófase I (Vesícula Germinativa) Metáfase II.
Em média, 70 - 90 % dos oócitos atingem MII.
FECUNDAÇÃO in vitro: Adicionar agentes capacitadores.
Sêmen congelado ou fresco;
Separação dos espermatozoides viáveis: centrifugação 600g por 30 min (Percoll 45% e 90%);
Lavagem dos espermatozóides viáveis;
Concentração: 1.000.000 sptz/mL;
Após lavagem, determinar volume do sedimento, motilidade e concentração;
Diluir para ter 100.000 sptz/4µL;
Inseminar microgotas;
Fecundação por 18 horas em meio contendo agentes capacitores (heparina, cálcio ionóforo, etc.).
CULTIVO IN VITRO:
Remoção mecânica do excesso de células do cumulus; pois elas podem competir por nutrientes no meio de nutrição do zigoto;
Colocação dos embriões em meios próprios para o desenvolvimento (co-cultivos ou meios quimicamente definidos) por 7 - 9 dias (Estufa CO2 a 39oC);
No 2o dia, acrescentar meio novo (Feeding) e avaliar clivagem (em média, 80%);
Do 7o ao 9o dia, avaliar taxa de blastocisto (30 - 50%).
DIA 1 AO D4 DE CULTIVO: Corpúsculo polar e pró-núcleos vão se dividindo.
 
 
DIA 5 DO CO-CULTIVO:			 
Mórula Compacta
Bom para congelar	
DIA 6-7 DO CO-CULTIVO: Blastocisto: Melhor fase para a transferência!!
DIA 7 DO CO-CULTIVO: 		 		 DIA 8 DO CO-CULTIVO:
 Blastocisto Expandido 
DIA 9 DO CO-CULTIVO:
					 Blastocistos Eclodidos
Blastocisto em Eclosão
Transferir com 7 dias a maioria dos embriões eram machopassaram a fazer transferência com 9 diasas células fêmeas estão mais equilibradaschances de ter produção meio a meio de macho e fêmea.
TRANSFERÊNCIA:
Idem a TE (selecionar receptoras sincronizadas); Ideal a receptora dar cio no dia após a aspiração (coleta) dos oócitos!!! Os embriões estarão envasados à 37 graus, palpar a vaca, ver o lado de CL e transferir para o corno do lado aonde há o CL;
Problemas com a congelação (diferença morfológica entre embriões TE e FIV).
Vitrificação: método alternativo.
EFICÁCIA DA METODOLOGIA DA PIV:
As taxas de maturação, fecundação e clivagem são semelhantes às taxas do processo in vivo.
No entanto, as taxas de cultivo (blastocisto) in vitro são significamente inferiores se comparadas às taxas in vivo.
Aproximadamente 30% dos oócitos colocados em maturação atingem a fase de blastocisto.
Essa taxa pode variar entre 5 e 60% dependendo da qualidade dos oócitos; do sêmen; do protocolo empregado no laboratório, da habilidade do técnico etc.
 IN VITRO X IN VIVO:
	ORIGEM DO EMBRIÃO 
	IN VITRO 
	IN VIVO 
	Taxa de prenhez à fresco 
	54% 
	76% 
	Taxa de prenhez congelados 
	30% 
	67%
	Mortalidade embrionária 
	+++ 
	+ 
	Perdas perinatais 
	15% 
	9% 
	Peso ao nascer 
	Aumentado: Devido ao SFB
	Normal 
Processo completo de PIV
: 
Coleta (OPU)
Maturação 24hrs
Fertilização: 18hrs
Cultivo: 7 a 8 dias
Transferência
Tempo total em torno de
 10 dias