ELETROFORESE 2013 2

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 ELETROFORESE
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Características básicas;
O fluxo determinante; 
Fatores envolvidos;
O ponto isoelétrico;
Tipos de eletroforese: 	
	Eletroforese livre,
	Eletroforese em suporte semi-sólido, 		Eletroforese em suporte sólido,	
	Eletroforese capilar, 		
	Focalização isoelétrica, 
 Eletroforese com SDS, 
	Eletroforese bidimensional,
	Eletroforese de alta voltagem,
	Immunobloting, 
	Iontoforese. 
6. Revelação;
7. Analise qualitativa e quantitativa;
Aplicações e procedimentos experimentais
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OBJETIVOS:
ELETROFORESE
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DEFINIÇÃO:
Processo de separação e/ou caracterização dos componentes de um sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, onde ocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas a um campo elétrico.
PRINCÍPIO:
Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessário que possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons, resultando em carga elétrica livre.
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ELETROFORESE
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 A eletroforese é especialmente útil como método analítico. Sua vantagem é que as moléculas podem ser separadas e visualizadas, permitindo determinar os componentes presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação particular de proteínas. 
 A eletroforese permite também a determinação de propriedades cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e sua massa relativa.
Técnicas especializadas de eletroforese como Western blotting, eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadas para detectar produtos gênicos extremamente escassos, encontrar similaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas. 
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ELETROFORESE
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Fracionamento e caracterização 
Aminoácidos
Peptídeos
Proteínas (lipo e glico)
Nucleotídeos
Ácidos carboxílicos
Adoçantes
Vitaminas
Corticoides
Pesticidas
Outras partículas que apresentem cargas em função do pH do meio.
ELETROFORESE
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Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólo de carga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas negativamente migram para o pólo positivo (anodo) e partículas carregadas positivamente migram para o pólo negativo (catodo).
 Na eletroforese a força elétrica, Fe que move a macromolécula é o potencial elétrico () , vezes a carga líquida da molécula (q).
A força que pára a migração da macromolécula é a fricção, Ff, que é proporcional a velocidade da partícula, V, vezes o coeficiente de fricção, ffr:
No caso do campo elétrico constante, as duas forças se balanceiam e a molécula migra com a velocidade constante.
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ELETROFORESE
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Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.
A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é proporcional ao valor da carga e o potencial elétrico.
O fluxo, J, é proporcional a:
 a carga pontual (q),
a concentração da molécula (C),
a área que o fluxo atravessa (A),
a mobilidade da molécula (u)
 o potencial elétrico 
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ELETROFORESE
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A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétrico depende de vários fatores:
	densidade de carga elétrica livre: 
principal fator, diretamente proporcional ao fluxo.
	potencial elétrico aplicado: 
diretamente proporcional ao fluxo. A voltagem aplicada deve ser adequada para separar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe os componentes. Voltagem muito alta aquece o sistema e prejudica a separação
	raio da partícula: 	inversamente proporcional
	viscosidade do meio: 	inversamente proporcional.
FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA:
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ELETROFORESE
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Outros fatores também influenciam na velocidade de migração:
	pH do meio (tampão);
	força iônica do tampão;
	interação com a fase fixa;
	tipo de suporte;
	grau de embebição (adsorção) do suporte;
	temperatura;
FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA:
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ELETROFORESE
A adsorção é a característica que certos suportes, principalmente o papel, agar e alguns tipos de agarose apresentam interagindo fisico-quimicamente com os anfolitos, como por exemplo, proteínas carregadas positivamente. Para eliminar este problema, devemos trabalhar com soluções-tampão cujo pH seja superior ao pI dos anfólitos, de modo que a carga dos anfolitos seja negativa e repulse a carga negativa presente nestes meios.
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PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é o valor do pH no qual as cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem. Não tendo carga elétrica efetiva, e portando, não migrando na presença do campo elétrico.
Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuem outros grupos dissociáveis:
Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3),
Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil, pK=12,5).
As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamento múltiplo dos aminoácidos componentes.
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ELETROFORESE
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PONTO ISOELÉTRICO
Quase todas as proteínas possuem o ponto isoelétrico exato, por exemplo:
Observe o ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela. 
Há alguma coisa errada? 
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ELETROFORESE
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As imunoglobulinas possuem pontos isoelétricos diferentes. 
Faça uma pesquisa e descubra o porquê. 
Observe os pontos isoelétricos das proteínas séricas. 
Para quais polos elétricos elas vão migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?
O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3. 
Há alguma coisa errada? 
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ELETROFORESE
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TIPOS DE SUPORTES ELETROFORÉTICOS:
ELETROFORESE LIVRE: 
Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo em forma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a maioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga e mobilidade diversas. O índice de refração nessa fronteira muda pela passagem das proteínas. Os movimentos de convecção provocados pela dissipação do calor exigem aparelhos e instalações especiais. É um método em desuso.
Diagrama esquemático da célula de Tiselius para medir a mobilidade eletroforética pelo método do movimento de fronteiras. 
No exemplo é mostrada duas diferentes espécies de proteínas carregadas negativamente, com diferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidas em solução tampão. Neste caso todas as proteínas migram para o ânodo. As mais rápidas assumem as fronteiras (1) tanto ascendente quanto descendente, ultrapassando, as mais lentas (2). Como resultado formam-se duas fronteiras em movimento ascendente e duas fronteiras em movimento descendente.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO 
ELETROFORESE EM SUPORTE: 
A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi-sólida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminando a convecção e os distúrbios de vibração. Diminui a difusão das substâncias, o que facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de maior resolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação a eletroforese livre. 
ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO: 
Os suportes sólidos mais usados são papel de filtro (EPF) e acetato de celulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagem com as proteínas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato de celulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhor fracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, o que não é possível em papel, e maior rapidez na separação. O processo de eletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados em zonas nítidas. A posição e quantidade das proteínas podem ser avaliadas por um densitômetro.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO 
(a) Diagrama do instrumental utilizado. A amostra é aplicada no centro do papel previamente umedecida pela própria solução tampão. As extremidades do papel são mergulhadas na solução tampão, na qual
os eletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico. 
(b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja que os íons positivos (cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativos em direção ao ânodo. Moléculas com carga resultante nula, permanecem no ponto de aplicação da amostra. 
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO 
Os suportes semi-sólidos mais usados são os géis de agarose e poliacrilamida. É possível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz pode retardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares.
 
 ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante ao descrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variação dessa técnica, bastante utilizada é a IMUNOELETROFORESE. 
IMUNOELETROFORESE: após a separação eletroforética da amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação para retirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados no gel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforética permite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedades eletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão) e pelas propriedades imunológicas (especificidade).
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO 
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA):
A eletroforese é realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida é um suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtração da amostra pela rede do gel, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção aproximada à massa de cada uma delas. Nesse caso há associação da separação por carga e por massa relativa. Nesse sistema as proteínas são separadas por suas massas relativas.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO 
Aparelhos e peças para eletroforese vertical
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
FORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização 
Gel de poliacrilamida
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Procedimento esquemático 
As amostras (misturas das proteínas a ser analisadas estão colocadas com ajuda das micropipetas, nos poços do gel (1-3). O campo elétrico está aplicado (4) e as proteínas migram com velocidades diferente (5, 6) dependendo das cargas elétricas livres e tamanhos.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
EM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA
Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel
Há dois tipos de géis: no topo o gel é com poros grandes e serve para concentrar as amostras; no baixo o gel é com poros menores e serve para separação as proteínas ou outros componentes do analise.
Esquema do gel em camada fina entre duasplacas de vidro. Aplicação das amostras e resolução das proteínas após revelação.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO
Revelação 
 A) corante Coomassie blue; B) coloração por prata
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ELETROFORESE
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 A) brometo de etídio; B) nitrato de prata; C) marcação radioativa; 
D) quimiluminescência; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.
ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO 
Revelação
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO 
Revelação
Visualização dos ácidos nucléicos
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO 
Revelação
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ELETROFORESE
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Eletroforese ácidos nucléicos
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ELETROFORESE
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Eletroforese na presença do SDS
Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e da massa relativa de proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-se à maioria das proteínas, provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidades grosseiramente proporcionais ao peso molecular de cada proteína e, em geral, na proporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O SDS ligado adiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando insignificantes as cargas intrínsecas da mesma.
 
  [CH3-(CH2)n-CH2-O-SO3-] Na+
Dodecilsulfato de sódio (SDS)
 
 A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria adquire, então, uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e, por esta razão, passam a ter uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na sua massa, com os polipeptídios menores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadas com SDS, perdem a carga intrínseca e adquirem carga negativa constante em relação a massa relativa. Sendo negativas, são atraídas para o ânodo e a separação ocorre segundo a massa relativa. As proteínas menores migram na frente, o inverso da cromatografica por gel-filtração. 
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 
NA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS). 
Exemplo do gráfico padrão para determinação da massa relativa
Eletroforetograma
Etapas:  
1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider); 
2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL); 
3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo da massa relativa das proteínas padrão; 
4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida, determine o Logaritmo da massa molecular . 
Descubra a massa relativa da proteína desconhecida, no Eletroforetograma ao lado. 
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Log da Massa Relativa
Migração Relativa
ELETROFORESE
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO 
A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de eletroforese. 
Nesse método, inicialmente, os anfólitos (uma mistura de ácidos e bases orgânicos, de pequena massa) são aplicados no suporte (um gel), após aplicarmos um campo elétrico num tempo curto (pré-corrida) para distribuir os anfólitos ao longo do gel e estabelecer um gradiente linear de pH no gel de poliacrilamida ou agarose. 
Uma mistura de moléculas com pontos isoelétricos diferentes é aplicada (1). As moléculas migram (2) até cada uma delas chegar ao local com o valor do pH igual ao seu pI (3). 
1
2
3
3
Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos
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ELETROFORESE
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO 
Resultado 
Quando uma mistura protéica é colocada no gel de poliacrilamida ou agarose cada proteína migra para o cátodo ou anodo até atingir o pH, que corresponde ao seu pI (ponto isoelétrico), formado uma área estacionária. Assim, proteínas com diferentes pontos isoelétricos distribuem-se de forma diferente ao longo do gel, formado uma área estacionária.
O processo da revelação é similar ao processo utilizado na nossa aula pratica com papel da celulose como suporte sólido: corante revelador e solução descorante. 
A separação das moléculas de acordo com seus pontos isoelétricos.
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ELETROFORESE
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Combinação de dois métodos eletroforéticos : 
1. focalização isoelétrica (IEF) e 
2. eletroforese na presença de SDS 
Em géis bidimensionais consegue-se a resolução de misturas mais complexas de proteínas. Este método composto é mais sensível do que a focalização isoelétrica ou a eletroforese em SDS sozinhos. A eletroforese bidimensional separa as proteínas de massa relativa idênticas, que diferem em ponto isoelétrico, ou proteínas com pI similar, porém massas relativas diferentes. 
Eletroforese bidimensional 
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ELETROFORESE
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Combinando os dois métodos: 
1. focalização isoelétrica (IEF) e 
2. eletroforese na presença de SDS 
A eletroforese bidimensional separa as proteínas de mesma massa relativa que diferem em pontos isoelétricos, ou proteínas com pI similares, porém massas diferentes. 
Revelado com o corante Coomassie.
Eletroforese bidimensional 
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ELETROFORESE
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Eletroforese bidimensional - Revelação
Cada pontinho representa um proteína diferente. A intensidade da coloração indica a quantidade da proteína.
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM 
Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema para separação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenos polipeptídios. 
Fonte externo para eletroforese
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ELETROFORESE
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“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método de diagnostico. 
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ELETROFORESE
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“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico. 
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ELETROFORESE
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Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos. 
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ELETROFORESE
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Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.
Densitogramas = curvas de absorbância
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ELETROFORESE
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Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.
Densitogramas = curvas de absorbância
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ELETROFORESE
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Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analises eletroforéticas 
Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados apenas nos densitogramas? Isto pode ser resolvido de duas formas:
1. Baseado na área do gráfico. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico ligando os pontos iniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemos utilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos x e y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como se usássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar o número de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido no gráfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a ele será atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas.
2. Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-se esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa das proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG.
Usar essa noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramas de eletroforese apresentados na pagina anterior.
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ELETROFORESE
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Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.
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ELETROFORESE
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A eletroforese das proteínas do soro, dentro de certos limites, tem importante papel na investigação clínica. A análise do diagrama eletroforético poderá ser feita por uma simples inspeção visual da fita, após coloração, ou através dos dados quantitativos obtidos por eluição da fita e leitura em fotocolorímetro ou pela leitura da fita no densitômetro.
A eletroforese do soro do adulto normal, usando tampão pH 8,6 de força iônica 0,05, resulta na separação de 5 componentes protéicos: 
Albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama globulinas. 
A fração albumina é a que mais se distancia do ponto de aplicação no sentido do pólo positivo. As frações globulinas são designadas pela ordem de mobilidade decrescente. Uma vez que a densidade da coloração das diferentes frações é proporcional as suas concentrações, a fração albumina é que se mostra mais densa.
Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas
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ELETROFORESE
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FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 	 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%
Globulinas:	Alfa 1 	0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%
 Alfa 2 	 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%
 Beta 		0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%
 Gama 	 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas
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ELETROFORESE
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GLOBULINA ALFA-1 AUMENTADA: Enfermidades agudas, crônicas de qualquer natureza (por exemplo, resfriados, furunculose); síndrome nefrótica; processos inflamatórios agudos. Neoplasias e outros; síndrome com destruição tissular; enfermidade de Hodgkin; úlcera péptica; gastroenterites agudas; colites ulcerosas e carcinoma gástrico.
GLOBULINA ALFA-1 DIMINUÍDA: Cirrose hepática, periarterites crônicas, hepatites por vírus, má absorção e má nutrição.
GLOBULINA ALFA-2 AUMENTADA: Síndrome nefrótica, icterícia obstrutiva, tuberculose pulmonar e extrapulmonar, mieloma múltiplo, enfermidade de Hodgkin, nefrose e glomerilonefrite, enfermidades do colágeno, diabete melitus, úlcera péptica, gastroenterites agudas, colites ulcerosas e carcinoma gástrico 
Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas
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ELETROFORESE
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GLOBULINA ALFA-2 DIMINUÍDA: Hepatites por vírus, cirrose hepática, síndrome de má absorção e má nutrição.
BETA GLOBULINA AUMENTADA: Especialmente em todos os processos em que há hiperlipemia como: síndrome nefrótica, mixedema, icterícia obstrutiva e mieloma múltiplo.
BETA GLOBULINA DIMINUÍDA: Leucemias mielogênicas e momocíticas, colites ulcerosas, nefrose e glomerulonefrites.
GAMA GLOBULINA AUMENTADA: Inflamações crônicas (entre elas endocardites bacterianas e hepatites crônicas), necroses hepáticas, enfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa, calazar (leishmaniose), linfogranuloma venéreo, cirrose crônica (ê característica a quase ausência de demarcação entre os picos beta e gama), sarcoidoses, artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.
GAMA GLOBULINA DIMINUÍDA: Baixa resistência por infecções, leucemias linfáticas, úlceras gástricas, colites ulcerosas, enterites agudas, câncer do estômago, nefroses, glomerulonefrites e enfermidades de má absorção e nutrição.
Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas
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ELETROFORESE
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Eletroforese em capilar: apresentação esquemática 
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ELETROFORESE
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Eletroforese em capilar 
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ELETROFORESE
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Tipos de eletroforese em capilar: 
Eletroforese zonal em capilar (EZC): é a forma mais simples de eletroforese em capilar e também é conhecida como em eletroforese em solução. A separação se baseia na diferença da razão massa/carga das substâncias. O fundamental na EZC é a homogeneidade da solução tampão e a uniformidade na intensidade do campo elétrico ao longo do capilar. O controle do pH do meio é muito importante uma vez que ele interfere na dissociação dos grupamentos acídicos e protonação dos grupamentos básicos do soluto. 
Eletroforese em gel no capilar (EGC): é uma adaptação da eletroforese em gel tradicional só que ocorrendo no interior do capilar, que é preenchido com uma solução de polímeros criando uma peneira molecular. Deste modo é possível separar pelo tamanho substâncias que apresentam a razão massa/carga similar. Está técnica é comumente empregada na determinação do peso molecular de proteínas e na análise de seqüenciamento de DNA. 
Focalização isoelétrica em capilar (FIC): possibilita que moléculas anfóteras como proteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e o anodo. As moléculas irão migrar até onde sua carga resultante seja zero. No ponto isoelétrico as moléculas estacionam em uma zona focada, que pode ser localizada utilizando um detetor de pressão ou por meios químicos. A FIC é muito utilizada para caracterização de proteínas. 
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ELETROFORESE
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Estudo clínico do plasma e outros líquido do organismo de mamíferos (EAC ou EPF);
Resolução
de misturas complexas de proteína, ácidos nucléicos e aminoácidos (EGPA, EGPA-SDS, FI);
Determinação da pureza e homogeneidade molecular (EGPA, EGPA-SDS, FI);
Determinação do pI das proteínas (FI);
Determinação da massa relativa (EGPA-SDS).
APLICAÇÕES:
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ELETROFORESE
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Determinação de alterações em amostras submetidas a ação de agentes químicos (drogas) ou físicos (radiações) - (EGPA, EGPA-SDS, FI);
Genética molecular (EGPA** ou EGPA-SDS)- testes de paternidade entre outros;
Testes mais refinados para diagnóstico (“immunoblotting” - teste para HIV) - (EGPA ou EGOA-SDS);
Veterinária (EGPA, EGPA-SDS, FI) - usado para avaliar alterações patológicas em animais;
 Taxonomia** (EGPA, EGPA-SDS, FI) - Classificação de espécies.
APLICAÇÕES:
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ELETROFORESE
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Obstáculos para penetração da pele: A resistência do estrato córneo (camada mais extrema da pele) impede a entrada de medicamentos: moléculas grandes têm muita dificuldade em atravessar a epiderme para os vasos sangüíneos da derme. 
Soluções: Os equipamentos utilizados nesse caso denominam-se os aparelhos para iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsos de eletricidade praticamente indolores que tornam a pele permeável. 
Iontoforese
A eletroforese pode ser utilizada para “injeção” de medicamentos através da pele.
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ELETROFORESE
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Iontoforese é um processo de facilitação da penetração dos tecidos biológicos para substâncias ionizadas (com cargas elétricas livres) quando submetidas a aplicação do potencial elétrico adequado.
As substâncias são geralmente os fármacos (antiinflamatórios, esteróides e anestésicos locais). Iontoforese é usada para transportar quantidades clinicamente significativas dos fármacos para região cutânea e subcutânea do tecido. 
A análise experimental e clínica demonstram a importância deste método na clínica, fisioterapia, dermatologia, otorrinolaringologia, oftalmologia, odontologia, e neurologia.
Iontoforese
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ELETROFORESE
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Mecanismos: Ionização e Eletroosmose 
 As drogas colocadas em meio aquoso são compostos iônicos que se dissociam em partículas carregadas positivamente e negativamente, portanto serão atraídos por eletrodos de sinal contrário.
Ionização -> ex. (fosfato de dexametasona sódica) 
(-) íon fosfato de dexametasona e (+) íon sódio. 
Iontoforese
A identificação da droga prediz a polaridade do eletrodo que será usados para mover ou entregar a droga ao tecido.
Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogas negativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)
O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado de eletrodo dispersivo.
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ELETROFORESE
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Eletroforese;
Electroosmose com cargas elétricas fixas negativas. Os poros seletivamente preenchidas com cátions que faz acontecer o fluxo da água (junto com os cátions) na direção do pólo negativo = catodo. 
Eletroosmose com cargas elétricas fixas positivas. Os poros seletivamente preenchidas com anions que faz acontece o fluxo da água (junto com os anions na direção do pólo positivo = anodo.
Esse fluxo leva as moléculas neutras e, também influi na migração das moléculas com cargas elétricas livres: freando aquelas que se movimentam contra fluxo da água e acelerando a migração de outras que se movimentam na mesma direção que a água.
Eletroosmose 
1.
2.
3.
*
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Então na eletroosmose o fluxo do solvente acontece enquanto o campo elétrico é aplicado sobre um meio poroso (membrana, pele....) com cargas elétricas fixas nas paredes dos poros.
Por esta razão os suportes (solido ou semi-solido) para a eletroforese sempre são feitos dos materiais sem as cargas elétricas fixas nos poros. 
Eletroosmose 
Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de cargas negativas que facilita migração dos cátions e o fluxo do solvente/água (junto com as substâncias dissolvidas) para o catodo. 
Fluxo: do anodo para catodo.
A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargas negativas) em pH entre 3 e 4 (Costello, et al 1995). 
Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições a pele apresenta excesso de cargas positivas que facilita migração dos anions e o solvente (junto com as substâncias dissolvidas) para o anodo. 
Fluxo: do catodo para anodo. Fonte da energia elétrica 
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ELETROFORESE
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Iontoforese: 
Eletroforese + Eletroosmose
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ELETROFORESE
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Princípios da Iontoforese
	A taxa de penetração da droga aumenta com:
Aumento da carga da droga
Aumento da corrente iônica
Decréscimo da massa molecular do íon
 (íons pequenos e leves apresentam maior mobilidade)
www.dexrx.com
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ELETROFORESE
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Curdy, C., Kalia, Y.N., & Guy, R.H
A resistência oferecida pela pele reside na camada superficial da epiderme, ou seja, estrato córneo, que limita a perda de água do corpo.
O estrato córneo é o maior obstáculo para a entrega de drogas transdérmica.
Princípios da Iontoforese 
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ELETROFORESE
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Banga, 1998
A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o estrato córneo tem 10-15 μm.
Os espaços intercelulares estão completamente cheios de lamelas que são compostas por lipideos, ceramidas, colesterol e ácidos graxos em quantidades praticamente iguais.
A morfologia dos lipídeos é importante para a função de barreira do estrato córneo.
Princípios da Iontoforese
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ELETROFORESE
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Robinson, A.J & Snyder-Mackler, L., 1995
Muitos compostos são carregados positivamente ou negativamente. Quando estes compostos são colocados em soluções apropriadas, dissociam-se em componentes que se comportam como íons. Estes íons podem ser influenciados pelo campo elétrico aplicado a solução, onde eles podem ser atraídos pelos pólos de sinais contrários. A força elétrica de repulsão destas cargas é a força motriz para a iontoforese.
 
Princípios da Iontoforese
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ELETROFORESE
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Teoria da Iontoforese
A densidade de corrente é medida pela corrente aplicada dividida pela área em centímetros quadrado do eletrodo.
A quantidade de drogas entregue depende da corrente total aplicada multiplicada pelo tempo.
A corrente contínua unidirecional causa irritação na pele, sendo tolerada em no máximo 1 mA/cm quadrado.
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ELETROFORESE
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Iontoforese vs Injeção
A iontoforese é um tratamento não invasivo é o risco para a pele é baixo.
A iontoforese permite um tratamento sem dor para pacientes que não suportam injeções.
A iontoforese minimiza os traumas que ocorrem nas injeções. 
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ELETROFORESE
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Iontoforese vs Via Oral
A iontoforese permite a aplicação de drogas sem que elas sejam absorvidas pelo trato gastrointestinal
A iontoforese é permite a aplicação de drogas transpondo o metabolismo hepático.
A iontoforese diminui os riscos de superdosagem.
 
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ELETROFORESE
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Fatores de Absorção
Fatores fisiológicos
As condições do leito vascular é importante, pois a vasoconstricção leva a uma diminuição do fluxo, enquanto a vasodilatação, aumenta-o.
Existem pequenas diferenças no fluxo de drogas por iontoforese em mulheres e homens.
A quantidade e o tipo de pêlos também afeta o fluxo de drogas na iontoforese.
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ELETROFORESE
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Penetração e Distribuição
A penetração dos íons
A penetração dos íons depende do tipo de tecido.
A profundidade é de aproximadamente 1 centimetro.
Alguns íons penetram até nos capilares subcutâneos.
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ELETROFORESE
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O aparelho para iontoforese
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ELETROFORESE
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Descreva o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhado de análise eletroforetica de uma amostra de proteínas.
Como determinar a quantidade relativa das proteínas num eletroforetograma?
Como a eletroforese pode ser utilizada em exames que auxiliam no processo de diagnóstico? 
Qual é o significado de cada um dos parâmetros que compõem a equação de fluxo migracional?
 Qual é o fator
mais relevante que determina a movimentação das proteínas do soro na eletroforese da aula pratica?
 
Quais fatores influenciam na velocidade de migração da partícula durante a eletroforese?
Lista de exercícios
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ELETROFORESE
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Defina ponto isoelétrico. Como determiná-lo experimentalmente de maneira rápida e com maior precisão? Qual é o tipo de substância que torna isto possível?
Descreva resumidamente os tipos de eletroforese. Em que situações se aplicam?
Em que tipo de eletroforese a massa relativa das proteínas tem maior importância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o mais relevante? 
Como revelar a localização das proteínas num eletroforetograma?
Como determinar a quantidade relativa das proteínas reveladas numa eletroforetograma? 
Que é e como funciona o densitômetro? 
Os corantes utilizados numa eletroforese (Lider e Revelador) possuem quais propriedades?
Lista de exercícios
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ELETROFORESE
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Analise eletroforetica das proteinas do plasma de um paciente
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ELETROFORESE
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PROCEDIMENTO
MATERIAL NECESSÁRIO:
 Cuba de acrílico para eletroforese, c/ponte de 11cm de largura, ajustável a 8,5 cm; 
 Fonte de corrente continua (200-300 V);
 Densitômetro (O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade das moléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração das moléculas numa solução (espectrofotômetro específico);
 Estufa, Fita de acetato de celulose 2,5x14 cm (Cellogel), Papéis de filtro, Pipeta automática, Tesoura, Pinça
 Placas de Petri, Amostra (soro)
 Corante líder (marcador da mobilidade máxima de qualquer partícula (molécula) numa eletroforese).
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ELETROFORESE
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PROCEDIMENTO
MATERIAL NECESSÁRIO:
 Tampão de corrida: - veronal sódico: 5,15g +EDTA 2,6g por 1 litro de água - pH=8,6, força iônica= 0,075
 Solução corante revelador: 	Amido negro 0,5g+metanol 45%+ ácido acético 10% em água.
 Solução descorante: 	metanol 47,5% + ácido acético 5% em água
 Solução desidratante:	 metanol
 Solução transparentizante: Metanol 85%+ ácido acético 14% +glicerol 1%
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
1 – Observar o sinal do polo elétrico marcado na canaletas da cuba. Colocar tampão de corrida nos dois lados da cuba, até a metade aproximadamente.
2 - Retirar com auxílio de pinça, a fita de acetato de celulose do pacote em que a mesma é acondicionada, mergulhá-la no tampão de corrida e agitar (movimento de vai-vem) durante 3-5 minutos.
3 – Retirar a fita da solução tampão com uma pinça (prendedo por uma extremidade), segurando-a na posição vertical em cima da cuba; remover o excesso de tampão da fita, tocando-a levemente na outra extremidade com uma folha de papel de filtro. Escolher o lado permeável da fita.
Obs: somente uma das faces da fita é permeável - a opaca.
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
4 - Sempre com o auxílio de pinça, esticar muita bem a fita na ponte. Observar que ambas as extremidades estejam em contato com a solução tampão e que o lado permeável da fita esteja para cima. 
5 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 3-5 minutos, para equilibrar a fita com a solução tampão.
6 - Desligar a fonte. Pipetar a amostra do soro com a pipeta automática e com a mesma colocar numa placa de Petri, misturando com o corante Líder. (O corante Líder é um corante que não tem afinidade por proteínas, mas migra com maior velocidade do que as proteínas. A distância percorrida pelo corante serve como uma distância padrão.) Aplicar 5 microlitros da amostra 1-2 cm distante do pólo negativo (POR QUE? Explicar!). Marcar a posição da aplicação da amostra picotando a fita lateralmente na mesma linha do ponto de aplicação da amostra.
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
7 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 30 minutos. Observar a corrida pelo movimento do corante lider.
8 - Desligar a fonte, marcar a posição do corante líder picotando com a tesoura os dois lados da fita onde o corante parou (chegada). Segurar a fita com a pinça e cortá-la em ambas as extremidades (~1 cm acima do ponto de partida e ~1 cm abaixo do de chegada). Coloque a fita na placa de Petri e aplicar a solução corante (no nosso caso é amido negro), por 30 segundos!
9 – Devolver o corante para o recipiente e aplicar a solução descorante agitando. Fazer várias lavagens a temperatura ambiente e duas com solução aquecida para remover o excesso do corante. A fita deve ficar novamente branca, exceto os locais onde tem proteína. OBS: O corante líder é quase totalmente removido.
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
Analise do Eletroforetograma
Medidas necessarios para identificação das proteinas. Distancia percorrida e Migração Relativa, 
Rf = DP/DL
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
10. Retirar a fita do descorante e estendê-la na parte de cima de uma placa de Petri. 
Medir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativa (Rf), definida como Rf= DP /DL , onde DP é distancia percorrida por proteína, mm, e DL é distancia percorrida por corante líder, mm. 
Compare seus dados com o padrão de migração relativa das proteínas nas nossas condições, as quais são: 
1. Gama-globulina- ~0.320.07; 2. Beta- globulina~0.600.07; 
3. Alfa2-globulina~ 0.730.06; 4. Alfa1-globulina~ 0.840.04; 
5. Albumina-~ 0.940.03
A partir da comparação indicar a localização das frações básicas às proteínas do soro no seu eletroforetograma.
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
11 – Na preparação da fita para leitura no densitômetro, antes devemos colocá-la por 30 segundos em metanol puro e logo em seguida, por 1 minuto na solução transparentizante.
12 - Retirar a fita do solução transparentizante, estendê-la na parte de cima de uma placa de Petri e deixar na estufa
13 - Retirar da estufa, esperar esfriar, colocar na mesa de um densitômetro para realização da leitura e determinação da quantidade (relativa ou absoluta) de cada proteína. 
até que a fita fique transparente (aproximadamente 1 minuto).
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO 
O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade das moléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração das moléculas numa solução (espectrofotômetro específico). 
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ELETROFORESE
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O resultado da leitura da fita está apresentado como um gráfico (chamada “densitograma” que soma de várias Gaussianas “picos”) onde as áreas sombreadas por cada Gaussiana (pico) representam a quantidade de proteína (ou qualquer outra substância que absorva a luz).
Soma todas as áreas = 100% das proteinas analisadas;
Área de qualque um - X
PROTOCOLO 
O densitômetro é construído para medidas da absorbância ao longo da fita com as proteínas coradas. 
FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 	 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%
Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%
 Alfa 2 	 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%
 Beta 	 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%
 Gama 	 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
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ELETROFORESE
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 Agora que temos o gráfico obtido com a análise densitométrica das corridas eletroforéticas, um pequeno problema se apresenta: Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na solução da corrida, baseados apenas no gráfico? Isto pode ser resolvido de duas formas:
1. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico (azul) e separamos os picos (vermelho). Depois as áreas de cada pico podem ser obtidas através da aproximação por uma ou mais figuras geométricas. Para saber a quantidade relativa das proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre as áreas de cada pico e a área total. 
2. Outra possibilidade é utilizar uma balança analítica e uma tesoura. Podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na fodo gráfaico. Em seguida pesamos esse recorte e anotamos o peso obtido (PG=peso total), referente a todo gráfico. Depois recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico
(as linhas vermelhas) e pesa-se separadamente. Para saber a quantidade relativa das proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total.
PROTOCOLO 
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ELETROFORESE
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1. Laboratório para o clínico. Livraria Atheneu Editora, 1991
2. Diagnósticos clínicos e conduta terapêutica para examines laboratoriais. Todd, Sanford, Davidsohn, Editora Monole Ltda, 1982.
3. Eletroforese. Peulo Cesar Nahum
4. Diagnóstico clínico e tratamento para métodos laboratoriais. J.B.Henry, Editora Mamole Ltda, 1999.
5. Na Bancada. Manual de iniciação cientifica em laboratórios de pesquisas biomédicas. Kathy Barker, Editora ArtMed, 2002
6. http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-B236EC5B641E
7. http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp
8. http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis
9. http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm
10. http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm
Bibliografia 
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
Dezenas de milhares de proteinas fazem parte do organismo. Bancos de dados arquivam inumeras constantemente. Muitas não tem funçao conhecida.
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
O nome dado ao polo oposto é igual ao da carga que está chegando. Se o polo está recebendo carga negativa entao ele é chamado anodo, se está recebendo carga positiva entao ele se chama catodo.
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
O sinal negativo indica que o fluxo é contrário ao gradiente.
A mobilidade eletroforética de uma partícula pequena e esférica é diretamente proporcional a sua quantidade de carga pontual (q) e inversamente proporcional a uma constante 6, a viscosidade do meio , e ao raio da particula r.
Para haver migração eletroforética de uma partícula carregada, além de ela está dissolvida ou dispersa no meio tamponado (tampão com pH cte.), este deve estar desequilibrado eletricamente. Assim, não só a referida partícula, como os demais iontes deste meio migrarao para um dos eletrodos da cuba eletroforetica de carga contraria àquela da substancia. O desequilibrio eletrico do meio é provocado por uma fonte de corrente continua com a capacidade de gerar uma força eletromotriz medida em volts. Independente do sistema eletroforetico entendido como um circuito eletrico, está aberto ou fechado, a fonte de corernte continua, quando acionada fornecerá uma certa voltagem que é resultado de sua capacidade de produzir fem com valores variaveis. Quando os terminais da fonte de corrente continua se ligam aos respectivos terminais ou eletrodos da cuba eletroforetica e a fonte é ligada, a voltagem do circuito eletrico depende da resistencia do meio onde se desenvolve a corrida eletroforetica.
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
As condiçoes eletroforeticas: para haver migração é preciso desequilibrarmos, eletricamente, duas regioes extremas de um meio contendo eletrólitos, meio este onde esteja dissolvida ou dispersa uma substancia com potencial para migrar. Para tanto, entre dois eletrodos ligados aos terminais de uma fonte de corrente continua são dispostos em dois compartimentos, catodico e anodico, contendo ambos, por via de regra, uma solução tampao, é estabelecida uma diferença de potencial. O meio fisico de separação (suporte), igualmente tamponado, se comunica através de suas extremidades com as soluções tampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico. A corrente eletrica ao passar pelo meio, conduzirá pelos pequenos iontes presentes na solução, dá ensejo ao deslocamento, de particulas proteicas carregadas para um determinado pólo catodo (-) ou anodo (+) em função respectivamente de sua carga líquida positiva ou negativa.
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
Proteinas no seu pI são precipitadas. 
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
pI é quando as cargas se equivalem, então isto seria possivel?
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
4-Amino-2,5-diethoxybenzanilide diazotated zinc double salt, 4-Benzoylamino-2,5-diethoxybenzenediazonium chloride hemi(zinc chloride) salt
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
 totalmente
ELETROFORESE
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