Resumo micro geral

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Microbiologia e Imunologia – Resumo Bloco 1 (Microbiologia Geral)
Stéphanie Casali
18/02/14
Introdução à Microbiologia
Os microorganismos são seres microscópicos unicelulares, os quais se diferenciam das células de eucariotos por serem capazes de viver de forma independente. Isso significa que eles realizam seus processos vitais independentemente de outras células. 
As características dos seres vivos são as seguintes: metabolismo (incorporação e transformação de nutrientes; excreção de compostos); reprodução (síntese de novas células a partir das pré-existentes); diferenciação (formação de uma nova estrutura celular como parte do ciclo celular); comunicação; movimento (propulsão) e evolução. 
As células são unidades estruturais e funcionais do ser vivo, podendo ser eucarióticas ou procarióticas. Ambas compartilham certas estruturas estruturas “chave” dos seres vivos: membrana citoplasmática, citoplasma, núcleo e ribossomos.
A partir da análise de rRNA 16-185: três domínios Bacteria, Archaea e Eucarya
Os microorganismos podem ser procarióticos (ex. bactérias) ou eucarióticos (ex.fungos e protozoários).
Impacto dos m-os na via humana: agricultura (fixação de N2), alimentos (laticínios), doenças, biotecnologia, agropecuária (bact. que degradam celulose no rúmen) e energia (produção de biodiesel)/meio ambiente. 
Bioremediação: uso de bactérias, fungos e plantas na degradação de compostos químicos tóxicos que se acumulam no meio ambiente. Os poluentes podem ser: naturalmente encontrados (óleo bruto, refinado, metais pesados) ou xenobióticos (pesticidas, herbicidas).
Biosurfactantes: surfactantes produzidos por m-os. Aplicação: recuperação de óleo dos poços. Vantagem do uso: potencial produção a partir de fontes renováveis de baixo custo. Desvantagem: atualmente o custo é alto.
Probióticos: m-os incorporados em alimentos e bebidas, com a finalidade de melhorar a saúde humana. 
Controle biológico: uso de antagonistas naturais para combater pragas, doenças ou plantas. As bactérias que formam esporos são candidatas a agentes de controle, pois produzem diferentes compostos com atividade inseticida e antimicrobiana, induzem crescimento e resposta de defesa em plantas, resistem a condições adversas do meio (esporos). Ex. Bacillus thuringiensis sintetiza a endotoxina δ durante a esporulação, a qual possui propriedade inseticida, pois induz a lise osmótica. 
Procariotos
As principais características diferenciais dos procariotos são: seu DNA não é envolvido por membrana e é um cromossomo circular (na maioria dos casos); outras proteínas, não histonas, estão associadas ao DNA; suas organelas não são revestidas com membranas; suas paredes celulares quase sempre contêm peptideoglicano; normalmente se dividem por fissão binária.
Célula Microbiana
Principais estruturas da célula bacteriana: 
Fímbrias e pili (algumas bactérias): função de fixação/aderência (reconhecimento de ligantes) e transferência de DNA (pili sexual o pili – F). São pelos mais curtos, retos e finos que os flagelos. Sua composição é proteica ou glicoproteica. Fímbrias e pilli são diferentes entre si, com relação a estrutura e morfologia.
Obs.: Também são chamadas de adesinas bacterianas. A cápsula também pode funcionar como adesina. Estratégias anti-adesão: saturação do ligante ou bloqueio por ação direta na bactéria. 
Parede celular: estrutura semi rígida responsável pela forma da célula, presente em quase todos os procariotos. Protege a membrana citoplasmática frágil e a célula das alterações no ambiente (impede a ruptura por conta de pressão, por exemplo). Nos procariotos, são mais simples estruturalmente e menos rígidas. 
Membrana plasmática: localiza-se no interior da parede celular, consistindo principalmente de fosfolipídios e proteínas. Fornece uma barreira entre meio externo e interno, além de garantir permeabilidade seletiva. 
Os principais fosfolipídios encontrados em membranas de procariotos são: cardiolipina, fosfatidilglicerol e fosfatidiletalonamina. Obs.: a composição de lipídeos de membrana do domínio Archaea é diferente dos outros dois, como por exemplo caldarqueol e arqueol, os quais possuem ligação do tipo éter entre o glicerol e os ácidos graxos. Esta ligação, mais forte que a éster, permite a sobrevivência em temperaturas mais elevadas. 
As membranas dos procaritos também apresentam hopanóides (semelhante ao colesterol, aumenta a rigidez) e glicolipídios. 
A fluidez das membranas é garantida pelos seguintes movimentos: difusão lateral (rápido) e difusão transversal ou flip flop (devagar). 
Proteínas de membrana: transmembrana, periféricas e ancoradas por GPI. Funções: barreira de permeabilidade (transporte), ancoragem de proteínas (envolvidas em transporte e bioenergética) e conservação de energia (local de geração e utilização da força próton motora). 
Ribossomos: formados por RNA ribossomal e proteínas. Participam da síntese proteica. As diferenças estruturais entre o ribossoma eucariótico e o procariótico conferem seletividade a certos reagentes. Enquanto o eucariótico é 80s (subunidades 60 e 40s), o procariótico é 70s (30s + 50s). 
Citoplasma 
Inclusões citoplasmáticas (algumas): de glicogênio (nutritiva, citoplasma); lipídica (polihidroxialcano e polihidroxibutírico); grânulos de fosfato ou volutina; magnetossomas (partículas magnéticas óxido de ferro; bactérias anaeróbicas que podem se orientar pelo campo magnético) 
Material genético (nucleóide): o cromossoma bacteriano localiza-se no nucleóide, mas há também um DNA extracromossiomial, o plasmídeo. O DNA bacteriano apresenta proteínas, tipo histonas. 
Endosporos (algumas): sistemas de diferenciação para uma estrutura de sobrevivência em meios não muito propícios à sobrevivência. São corados com verde malaquita + mercúrio cromo. Seu córtex possui peptidoglicana incompleta e seu exósporo, uma dupla capa proteica. É um estado latente de sobrevivência que deverá germinar para gerar uma célula.
Flagelo (algumas): longo prolongamentos proteico e filamentoso que propele as bactérias. Insere-se a nível de membrana por um anel (as gram – possuem mais de um anel). Afinidade migracional para ambiente atrativo (taxia), com um agente nutricional, por exemplo. 
Cápsula (algumas): camada de polímero (polissacarídica ou polipeptídica) que reveste e está firmemente aderida à parede celular (glicocálix), sendo extremamente organizada. Por ser polissacarídica, pode funcionar como reserva nutritiva ou energética e para retenção de H2O. É uma estrutura externa que dificulta a ação do sistema imune, por proteger diversos ligantes que seriam reconhecidos por esse sistema para a fagocitose. As bactérias encapsuladas estão envolvidas na patogenicidade bacteriana. 
A cápsula bacteriana pode ser evidenciada por tinta nanquim (não colore a cápsula) e anticorpo anti-polissacarídeo capsular. 
Tipos de transporte na célula bacteriana
Difusão passiva
Difusão simples
Transporte ativo:
Translocação de grupo: ocorre a hidrólise do fosfoenolpiruvato, cujo fosfato é transferido pelas enzimas para a substância química transportada. Ex.: glicose-6, fosfato. 
Sistema ABC: proteínas de ligação levam a molécula à proteína transportadora, cuja entrada é favorecida energeticamente pela hidrólise de ATP. 
Bactérias Gram + e Gram –: divisão no domínio Bacteria. As gram positivas são aquelas que apresentam alto conteúdo de peptidoglicana em sua parede celular (estrutura básica da parede), enquanto as negativas apresentam peptidoglicana em baixo conteúdo no periplasma e sua parede celular localiza-se entre a membrana citoplasmática e a membrana externa. 
A peptidoglicana é composta por dissacarídeo repetitivo (n-acetilglucosamina e n-acetilmurâmico, em ligação β- 1,4) ligado por polipeptídeos para formar uma rede que circunda e protege a célula. As cadeias laterais de peptídeos (tetrapeptídeos) podem estar ligadas diretamente umas nas outras, ou por meio de uma ponte cruzada (ou interpeptídica). 
A estrutura da peptidoglicanaentre esses dois grupos também é diferente. O esqueleto de glicana é igual. No entanto, a cadeia peptídica é diferente, assim como é um diferencial a presença de uma ponte interpeptídica (ponte de Gly) nas bactérias gram positivas. 
Uma outra característica das bactérias gram positivas é que sua parede apresenta peptidoglicana entremeada por ácido teicóico (álcool + fosfato, sendo este álcool ribitol ou glicerol) e ácido lipoteicóico (ligado à membrana citoplasmática). 
Já as bactérias gram negativas apresentam a seguinte estrutura em sua parede celular: peptidoglicana + membrana externa (lipopolissacarídeo + porinas) + lipoproteína. 
Obs.: lipopolissacarídeo – LPS, açúcar voltado pro meio externo. A estrutura do LPS é a seguinte: em sua extremidade mais externa fica o antígeno 0 (porção reconhecida pelo sistema imune), sendo composto também pelo lipídeo A (endotoxina bacteriana, liberada na morte). Ambos são reconhecidos por receptores tipo Toll (TLR4), havendo uma cascata de sinalização que culmina na produção e liberação de citocinas pró-inflamatórias. O antígeno 0 ativa o sistema imune adquirido (produção de anticorpos), enquanto o lipídeo A ativa o inato. 
A classificação de gram não serve para Archaea, uma vez que a parede celular neste domínio é diferente, apresentando grande variedade.:
Pode haver a presença de peseudopeptidoglicana, na qual a ligação β-1,4 das Bacterias é substituída pela β-1,3. Consequentemente, este complexo torna-se insensível a ação da lisozima. 
A maioria das arqueas também possuem a camada S, a qual tem composição glicoproteica. Algumas bactérias também podem ter camada S. 
Ainda, pode-se observar sulfatação de polissacarídeos da membrana.
Em micobactérias: composição lipídica, coradas sob aquecimento. Em eucariotos com parede celular (fungos): composição química majoritária de carboidratos, não há peptidoglicana.
Biofilme: empilhamento de microorganismos imersos em uma matriz polissacarídica (glicocálice). Há canais que levam nutrientes vitais para todas as camadas, e também excretas das camadas mais inferiores. O esforço cooperativo favorece a proteção. É difícil de destruir, sendo muito presente em superfícies polidas. Ex.: placa dental cárie. A resistência a antibióticos torna difícil o controle hospitalar. 
Nutrição e Crescimento Bacteriano
O metabolismo celular é dividido em processos catabólicos (quebra de moléculas complexas em moléculas mais simples) e anabólicos (biossíntese de moléculas). Na biossíntese, os nutrientes obtidos do meio são assimilados pela célula e transformados em componentes celulares, com custos energéticos. Já no catabolismo, a partir de uma fonte energética, substratos são degradados, gerando energia para os processos anabólicos de crescimento, para o transporte celular e o movimento da célula. A nutrição adequada (nutrientes + fatores de crescimento) dos m-os condiciona seu crescimento.
Localização de biomacromoléculas em uma célula bacteriana
Classificação dos m-os com relação à fonte de carbono: autotróficos quando o C é inorgânico e heterotróficos quando ele é orgânico.
Qual a forma química fornecida dos nutrientes?
Carbono – orgânico (glicose, acetato, piruvato, extrato de carne, etc); inorgânico (Co2 ou HCO3-)
Oxigênio – H20, O2, CO2
Nitrogênio – orgânico (aminoácidos e bases nitrogenadas) e inorgânico (bact. fixadoras de N2 – N2, NH4Cl e KNO3)
Fósforo – KH2PO4 e Na2PO4
Enxofre – Na2SO4 e H2S
Potássio - KCl
Magnésio - MgCl2, MgSo4
Ferro – FeCl3
Micronutrientes – sais de cobalto, molibdênio, cobre...
Fatores de crescimento (vitaminas): os microorganismos auxotróficos são aqueles que necessitam de outros nutrientes para crescer, pois geralmente são mutantes na via de síntese dessas vitaminas. 
Meios de cultura: definido ou sintético (sabe-se quantitativamente e qualitativamente toda sua composição química – para E.coli) e complexo (para crescimento de fungos).
Ágar: polissacarídeo inerte usado para solidificar o meio de cultura.
Fatores ambientais
Temperatura: a temperatura influencia o crescimento bacteriano a nível enzimático.
As bactérias podem ser classificadas quanto a sua temperatura ótima: psicrofílicas (temp ótima muito baixa), mesofílicos (T.A. é a temp ótima), termofíilicas (temp ótima alta), hipertermofílicas (temp ótima muito alta). A composição da membrana plasmática é importante para esta classificação, pois depende da proporção entre fosfolipídeos e proteínas, assim como se os ácidos graxos são insaturados ou saturados. Por exemplo, as bactérias psicrofílicas possuem maior teor de ptns em alfa hélice (mais flexíveis) e ácidos graxos insaturados. 
Oxigênio: bactérias aeróbias, anaeróbias e facultativas. As bactérias anaeróbias não sobrevivem na presença de oxigênio, pois não possuem enzimas de detoxificação de espécies reativas de oxigênio. 
NaCl: é muito específica. Bactéria não halófilas não crescem já em pequenas quantidades de NaCl. As halotolerantes crescem até certo nível de NaCl, enquanto os halófilos crescem em altas concentrações de NaCl e os halófilos extremos em concentrações saturadas.
 pH
Fissão binária: reprodução bacteriana após crescimento. Primeiro ocorre a replicação do DNA, depois a elongação celular e formação do septo. Em seguida, o septo é finalizado, as paredes se tornam distintas e, por último, ocorre a separação das células. O tempo de geração é aquele que decorre para que uma bactéria vire duas. Este tempo depende de temperatura, do meio e da espécie. G = t/n, onde G é o tempo de geração, t é o tempo total e n o núm de gerações.
 
Anel Fts Z: é um tipo de citoesqueleto em procariotos, é proteico e auxilia na separação das células durante a divisão celular. 
Equação do crescimento bacteriano: N = No x 2n 
Curva de crescimento bacteriano: (no caso de não se adicionar mais nutriente no meio)
Fase lag: adaptação ao meio.
Exponencial: crescimento máximo.
Estacionária: liberação de produtos tóxicos se equilibra com a taxa de crescimento.
Morte: também é exponencial (os produtos tóxicos são cada vez mais).
Avaliação do crescimento bacteriano: contagem de células totais, contagem de células viáveis ou avaliação da massa celular (peso seco).
Contagem de células totais em câmara de Petroff-Heuser rápido, mas não considera vivo/morto, e as bactérias são muito pequenas para este tipo de contagem.
Método de diluição: a amostra é diluída sucessivamente em 1mL de amostra para 9mL de salina até 1/106. Os tubos diluídos são plaqueados e utiliza-se o número de células da placa de uma diluição que tenha gerado UFC entre 30 e 300. Por último, faz-se uma regra de três para avaliar o número na amostra original.
Turbidimetria: leitura em espectrofotômetro (mais ou menos 540nm) da densidade óptica. Para saber o que cada D.O. representa, tem que se acoplar com o método de diluição. 
Produção de Energia
Os microorganismos se classificam quanto à obtenção de energia em autotróficos e heterotróficos. Os primeiros utilizam a energia solar para a produção de energia, enquanto os últimos compostos orgânicos (quimiorganotróficos) ou inorgânicos (quimiolitotróficos). 
Os três principais processos de obtenção de energia são: respiração, fotossíntese e fermentação. 
Fermentação
É a oxidação ou degradação parcial de compostos orgânicos com a produção de outros compostos que ainda possuem energia utilizável. 
Reação geral de uma fermentação: C6H12O6 2etanol + 2CO2 + 2ATP
A glicose é oxidada pela via glicolítica (citoplasma), virando 2 piruvato + 2ATP (fosforilação a nível de substrato). Forma-se também NADH que será reoxidado por meio de produtos da fermentação microbiana. Na fase preparatória da glicólise, gasta-se 2 ATPs, que serão compensados nas fases seguintes com a produção de 4ATPs. Há diversas fermentações microbianas.
Fermentação alcoólica – em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e em bactérias (Zymomonas)
Respiração aeróbica: oxidação total de compostos carbônicos, indo a CO2 e H2O, produzindo 36 a 38 ATPs
 
Inclui reaçõesde oxidação e desidrogenação, com as seguintes etapas: via glicolítica, oxidação do piruvato, ciclo de Krebs, cadeia de transporte de elétrons e quimiosmose; ocorrendo a nível de membrana plasmática.
Quimiosmose: obtenção de ATP associada a um gradiente eletroquímico de H+ através de uma membrana. Ocorre por meio de proteínas ATP sintases, que utilizam a força eletromotriz criada. 
Respiração anaeróbica: uso de moléculas inorgânicas (que não o O2) como aceptoras finais de elétrons. Há, por exemplo, a respiração do nitrato, do sulfato e das bactérias metanogênicas, onde CO2 é reduzido a CH4. 
Fotossíntese: conversão da energia luminosa em energia química, que é utilizada para converter o CO2 em moléculas orgânicas reduzidas. Quem faz? Cianobactérias, bactérias púrpuras e verdes do enxofre, algas e plantas. Ela é oxigênica quando há produção de O2 e anoxigênica quando outros compostos são produzidos (bact. púrpuras – S). 
Fase clara: obtenção de ATP e NADPH Como? Fotofosforilação cíclica ou acíclica.
Na acíclica, os elétrons não retornam para a clorofila. Assim, retira-se elétrons de outras moléculas (H2O), com a deposição de O2, ou de H2S, com deposição de S.
Fase escura: fixação do CO2
Quimioterápicos
Substâncias produzidas por microorganismos (neste caso, chamadas de antibióticos) ou sintetizadas em laboratório com ações anti-microbianas. Suas propriedades desejadas são: toxicidade seletiva e ação bactericida (ação bacteriostática não é desejável).
Para definir a concentração desejada de antibiótico, é necessário observar o MIC (concentração mínima inibitória), na qual haverá crescimento mínimo na presença de certa concentração de antibiótico; e o MBC (concentração mínima bactericida), que é a primeira concentração de antibiótico capaz de inibir o crescimento microbiano em questão.
 
Locais de ação dos quimioterápicos
Biossíntese da parede celular, na membrana plasmática, na biossíntese de DNA, proteínas, mRNa e ácido fólico.
Quimioterápicos que atuam na biossíntese da parede celular de células bacterianas: só têm ação na parede celular não formada; sendo específicos para bactérias (peptidoglicana).
Na biossíntese da parede celular, o citoplasma mobiliza açúcares e aminoácidos, que se agrupam em blocos (bloco básico-PEG). Com auxílio de lipídeos carreadores (terpenos), esses blocos básicos são transportados para fora da membrana, polimerizando-se por etapas de transglicosilação e transpeptidação. 
Antes da reação de transpeptidação, os blocos possuem um dímero de D-Ala em sua cadeia peptídica, o qual será importante para esta reação. A quebra de uma D-Ala libera energia para a formação da ligação entre o 3º AA de uma cadeia com o 4º da outra.
Penicilina e análogos (possuem anel β-lactâmico) ação ocorre na parede celular
Inibem a síntese da parede, pois são análogos estruturais do terminal D-Ala – D-Ala, graças à presença do anel beta lactâmico, formando um complexo irreversível com a transpeptidase e afetando a reação de transpeptidação. 
Além desta ação, a penicilina induz a liberação de autolisina lise e morte celular
Nas células gram negativas, esta classe de antibióticos se liga a PBPs.
Cicloserina (ação ocorre no citoplasma)
É análogo estrutural da D-Ala, tornando-se um inibidor competitivo da alanina racemase (etapa de incorporação dos Aas, transforma L em D alanina). A cicloserina também impede a ação da alanina sintetase (Etapa de dimerização de D-ala—D-ala).
A estrutura estável de seu anel coloca a molécula em uma posição estericamente favorável, permitindo a ligação preferencial destas enzimas, quando comparada a seu substrato natural. 
Vancomicina (ação ocorre na membrana plasmática)
Inibe a reação de transglicosilação, pois se liga por ligações de hidrogênio com o terminal D-ala – D-ala, distorcendo o bloco básico, de forma que este não é mais reconhecido pela transglicosilase.
Bacitracina (ação ocorre na membrana plasmática)
Impede a defosforilação de um lipídeo carreador, o bactoprenol, impedindo-o de receber um bloco básico.
Quimioterápicos que alteram as funções da membrana celular bacteriana
São considerados mais tóxicos, pois atuam em uma estrutura comum às células eucarióticas.
Polimixinas: atuam nos fosfolipídeos de membrana, como detergentes catiônicos, formando poros que desestabilizam a função da membrana, pois altera sua permeabilidade seletiva.
Peptídeos antimicrobianos (catiôicos): são quimioterápicos ainda em fase de teste, mas seu mecanismo de ação também envolve a formação de poros, de várias formas (tipo barril, tipo tapete, etc.)
Agentes antifúngicos e seus alvos na célula fúngica
Anfotericina B: possui uma região hidrofóbica com afinidade por ergosterol (estrutura cilíndrica), mas não por colesterol (estrutura sigmoide). Assim, leva à formação de poros na membrana plasmática. 
Azóis: ligam-se ao centro ativo da enzima 14 alfa-demetilase, envolvida na síntese de esteróis. O bloqueio nesta via pode provocar a síntese de esteróis tóxicos. Ex.: fluconazol. 
Quimioterápicos que atuam inibindo a biossíntese de DNA
Inibem a síntese de DNA por inibir a DNA girasse/topoisomerase, a enzima envolvida na abertura da dupla-fita impedimento da replicação celular
Ex.: quinolonas e ácido nalidíxico: complexam-se à topoisomerase, impedindo a replicação.
Quimioterápicos que atuam na biossíntese de RNA
Rifamicina: liga-se à subunidade beta da RNA polimerase, bloqueando a entrada de um novo nucleotídeo durante a síntese de RNA.
Quimioterápicos que atuam na biossíntese de proteínas
Tetraciclina: atua na subunidade 30s do ribossoma e bloqueia tRNA, impedindo a entrada de Aas na cadeia peptídica crescente.
Clorofenicol: atua na subunidade 50s do ribossoma, inibindo a enzima peptidil transferase e bloqueando a formação das ligações peptídicas. 
Eritromicina: se liga na subunidade 50s, impedindo a reação de translocação.
Aminoglicosídeos: atuam na formação do complexo de iniciação, complexando-se com o mRNA e gerando informação errada e ptn defeituosa. Ex.: gentomicina, kanamicina e estreptomicina. 
Quimioterápicos que atuam na via de síntese do ácido fólico
Sulfonamidas: atuam por analogia estrutural na pteridina sintetase, que teria o PABA como substrato impedimento estérico
Trimetoprimas: inibem a dihidrofolato redutase
Mecanismos de resistência a quimioterápicos
Efluxo da droga: a droga entra mas é expulsa da célula; ex.: eritromicina e tetramicina.
Inativação da droga: ação do sitio ativo. Ex.: penicilina é alterada pela penicilase ou β-lactamase.
Alteração da droga por modificação estrutural: adição de radicais, fosforilação, grupamentos; não ocorre por ação enzimática. Ex.: rifampicina e aminoglicosídeos.
Modificação da molécula alvo: modificação do alvo de ação da droga.
Noções de Genética Bacteriana
Mutações: alterações na sequência de bases do DNA. Na primeira replicação, esta alteração não tem efeito, mas na segunda ou terceira, sim. O número de ocorrência em uma população bacteriana é pequena.
- Como ocorrem? Espontaneamente (ausência de agentes) ou Induzidas (agentes mutagênicos).
- Tipos: de ponto (um único par de bases é substituído) ou no código de leitura (um ou mais pares de bases são inseridos/deletados).
- As mutações podem ser silenciosas, quando geram uma ptn normal; sem sentido quando a ptn fica incompleta (ocorre no códon de terminação) e de sentido trocado quando ela é defeituosa. Esses efeitos dependem da função da ptn.
Os mutantes presentes em uma população bacteriana podem ser identificados por meio de: uma seleção positiva (o meio é escolhido para que as células cresçam e apresentem fenótipos diferentes, ex.: mutantes resistentes a antibioticos) ou uma seleção negativa (as células mutantes não crescem, ex,: mutantes sensíveis a temperatura e mutantes auxotróficos).
Agentes indutores: químicos ou físicos
- Análogos de base: inserem-se no lugar de uma base e provocam pareamento e outra base. Ex.: 5,bromo uracil0 – na forma ceto pareai com adenina (2 ligações), mas na forma enol pareia com guanina (3 ligações).
- Ácido nitroso: provoca perda de grupamento amino das bases e provoca pareamentos errôneos/
- Agentes alquilantes: inserem-se nas bases e mudam opareamento
- Agentes intercalantes: inserem-se nas bases adjancentes do DNA, distorcendo a estrutura tridimensional do DNA, ex.: brometo de etídio
- Radiações UV: dimerização de timinas
- Radiações ionizantes: degradam o DNA e peroxidam lipídeos
Teste de Ames: avalia o potencial mutagênico de compostos potencialmente terapêuticos
Neste teste, utiliza-se mutantes de Salmonella que requerem algum fator para o seu crescimento. A substância teste é colocada juntamente com a cultura para verificar o aparecimento de colônias reversas (mutações reversas). 
Recombinação gênica: quando ocorre transferência de DNA entre células, formando uma célula recombinantes. Essa transferência pode ser por transformação, trandução ou conjugação. 
Experiência de Griffin: “princípio transformante” – identificação do DNA como molécula que transfere a informação.
Transformação: pedaços de DNA livre se transferem da célula doadora para a receptora. Para que a célula seja receptora, ela precisa ser compete, isto é, possuir um maquinário que permita receber os fragmentos de DNA e incorporá-los. Este maquinário inclui: proteína de ligação ao DNA (extracelular), proteína de ligação ao DNA de fita simples (intracelular, protege da ação de nucleases), proteína RecA (incorpora o DNA recebido ao cromossomial por região de homologia) e nuclease (extracelular, quebra a dupla fita).
Transdução: via injeção viral (bacteriófago). Ocorre quando um bacteriófago ataca uma bactéria e, após seu ciclo lítico, incorpora um fragmento do DNA da célula hospedeira e, ao atacar outra célula, transfere este fragmento. Ele pode, então, ser incorporado no DNA cromossomial da biva células hospedeira pela RecA.
Conjugação: transferência de plasmídeo (sozinho ou integrado ao DNA cromossomial), quando duas células estão ligadas, formando um par conjugante. A célula doadora é denominada F+, pois contém o plasmídeo F (fertilidade), e a receptora de F-. Quando o plasmídeo se integra ao cromossomo, a célula doadora é chamada de Hfr e fragmentos do DNA cromossomial podem ser transferidos para a receptora. 
No caso de bactérias gram negativas, a conjugação ocorre pela união entre o pilus sexual da doadora e o LPS da receptora, as quais se atraem pela liberação de ferormônios produzidos pela célula receptora. 
Diferentes funções dos plasmídeos: resistência a antibióticos, sexual, metabólica, virulência.
Prática
Definições
Cultura pura – crescimento, em meio nutritivo adequado, de um conjunto de células da mesma espécie.
Desinfecção – inativação ou redução do número de m-os presentes em local inanimado, eliminando potencialidade infecciosa.
Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida em determinado material/ambiente.
Assepsia – desinfecção aplicada a matérias vivas.
Manobras assépticas – trabalhar na zona de segurança, flambar a alça ou agulha microbiológica; deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo; flambar a boca do tubo; nunca apoiar a tampa ou rolha do tubo na bancada.
Métodos físicos no controle do crescimento microbiano
Temperatura: atua em enzimas. O frio tem efeito estático, reduzindo a taxa de crescimento. Esporos suportam temperaturas maiores que 100ºC. 
- Calor seco: fornos ou estufas. 1 a 2 horas a 180º C esterilizam vidraria e materiais danificáveis pela umidade; flambagem ou chama direta; incineração.
- Calor úmido: maior poder de penetração vapor de água causa rearranjo de pontes de hidrogênio desinfecção. Abaixo de 100º C é pasteurização; acima de 100º C + pressão alta autoclavação (121º C – formas vegetativas e esporuladas) ou UHT (“ultra high temperature”- 140 a 150º C, alimentos).
Ex.: B. subtilis (G +, produz esporos) – se submetida até fervura de 20 min, sobrevive; apenas a autoclave é um método eficiente de esterilização. Ferver apenas desinfecta. 
Radiação
- Raios gama: alta penetração; gera radicais livres que atuam no DNA a nível de mutações, prejudicando a replicação.
- Raios UV: baixa penetração, também gera radicais livres.
Filtração
Algodão, discos filtrantes, membranas filtrantes, filtros HEPA, velas bacteriológicas para materiais termolábeis, como soros, enzimas, meios de cultura, etc.
Métodos químicos no controle do crescimento microbiano
Em tecido vivo ou superfície inanimada, com efeito temporário ou permanente. Nenhum desinfectante é apropriado para todas as circunstâncias. Os parâmetros que devem ser considerados são estes: propriedades gerais, concentração, natureza do material, contato com o m-o, tempo de contato, temperatura ideal. 
A avaliação do desinfectante pode ser feita por: teste de diluição ou método do papel de filtro (halo de inibição). 
Substâncias utilizadas: fenol e agentes fenólicos ( ruptura de membrana plasmática e inativação de ptns); álcoois (inefetivo contra endósporos não envelopados); halogênios (cloro forma agente oxidante forte e iodo, ex. lugol, reage com tirosina, inativando ptns); sabões e detergentes aniônicos (ação mecânica); detergentes ácidos-aniônicos; detergentes catiônicos (inativa ptbs), peroxigênios (oxidação); esterilizantes gasosos como ócido de etileno (desnaturação de ptns e ação mutagênica); metais pesados e seus compostos (ligação ao enxofre da cisteína).
Coloração de Gram
O corante primário, cristal violeta, é capaz de corar ambos tipos celulares, pois penetra no citoplasma dos dois. Quando o lugol é aplicado, forma cristais com o corante muito grandes incapazes de atravessar a parede celular. Nas bactérias gram positivas, o álcool desidrata a peptidoglicana para torná-la mais impermeável ao cristal iodo-violeta. Já nas negativas, o álcool dissolve a membrana externa, deixando também pequenos buracos na camada de peptidoglicana. Como as negativas ficam incolores após o álcool, o contracorante cora as mesmas de rosa. 
Exame Microscópico de Microorganismos
- Preparações observadas a fresco (amostra + meio): baixo contraste difícil observação. 
- Preparações fixadas e coradas: são observadas características dos próprios microorganismos e dos corantes
Coloração simples: solução aquosa/alcoólica de um corante básico, usada para destacar os m-os. Ex.: azul de metileno, safranina, etc.
Coloração diferencial: reage de forma distinta aos diferentes tipos de bactéria.
Coloração de Gram
Coloração de resistência ao álcool-ácido
Coloração especial: ex. negativa para cápsula, coloração para endósporos
- Preparação a fresco de m-os crescidos em suspensão: flambar a alcar e colocar uma gota da suspensão em uma lâmina, colocar lamínula. 
- Preparação a fresco de m-os crescidos em colônia: colocar gotas de salina em uma lâmina com a alça flambada. Depois, colocar um pouco de crescimento e misturar.
Técnicas de isolamento e contagem de m-os
Meios de cultura: material nutriente preparado para o crescimento de microorganismos
- Meio de enriquecimento: utilizado antes do isolamento, como um método para enriquecer os m-os de interesse frente aos outros. É adequado para aumentar a populcao de m-os mais exigentes em termos nutricionais.
- Meio seletivo: para o crescimento de uma população especifica de m-os
- Meio diferencial: adição de substancia para diferenciação
	Isolamento
- Método de semeadura: pode-se fazer a semeadura em meios sólidos e observar o formato de diferentes colônias, coloração delas, etc.; ou fazer semeadura por esgotamento. Nesta técnica, emprega-se o isolamento de uma espécie que esteja presente em grande número no meio de cultura.
Como? Utilizar quantidade pequena de inóculo e realizar o maior número possível de estrias na metade da placa, sem perfurar o meio, nem voltar com a alça pelas estrias anteriores; virar a placa e estriar mais uma região, virar mais uma vez e estriar o restante. 
Provas Bioquímicas
-Necessário ter uma cultura pura
- Testes para auxiliar na identificação e classificação dos m-os
- Evidencia as características metabólicas e fisiológicas das bactérias e leveduras
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento.