Cromatografia - Parte II

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Prof. Valmir F. Juliano 
QUI624 
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
CROMATOGRÁFICOS 
Análise de substancias voláteis e estávesi termicamente 
Boa resolução e sensibilidade 
 
Técnica de desenvolvimento mais usada é a eluição 
 
Fatores que afetam a eficiência da coluna: comprimento, 
diâmetro interno, temperatura, vazão da fase móvel, volume 
da amostra, técnica de injeção, características das 
substancias, etc. 
 
 
Cromatografia gasosa 
Quantificação da eficiência 
Cromatografia 
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados 
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: 
Cada “estágio” de equilíbrio é 
chamado de PRATO TEÓRICO 
O número de pratos teóricos 
de uma coluna (N) pode ser 
calculado por: 
Coluna mais 
eficiente 
tR 
wb 
N 
Cromatografia gasosa 
 Derivação ou derivatização – consiste em transformar a substancia de 
interesse em um derivado com características adequadas para serem analisadas 
por CG. 
 
 Objetivos da derivatização química em análises cromatográficas: 
 
 Aumento da sensibilidade na detecção de compostos 
 
Atribuição de volatilidade 
 
Melhora da estabilidade térmica 
 
Melhora da resolução cromatográfica (separação de picos) 
 
Melhora da quantificação 
Cromatografia em fase gasosa 
Cromatografia 
Coluna: contendo a 
fase estacionária 
está submetida à 
temperaturas 
controladas 
Fase móvel: 
gás inerte 
Detector: 
submetido à 
temperatura 
controlada 
Injetor: submetido 
à temperatura 
controlada 
Cromatografia Gasosa 
Aplicabilidade 
Quais misturas podem ser 
separadas por CG ? 
Misturas cujos constituintes sejam 
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) 
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de 
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. 
DE FORMA GERAL: 
 CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos 
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que 
sejam termicamente estáveis. 
Requisitos - Gás de arraste (FM) 
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem 
com a fase estacionária ou superfícies. 
PURO: Deve ser isento de impurezas que 
possam degradar a fase estacionária. 
Impurezas típicas em 
gases e seus efeitos: 
oxida / hidrolisa algumas FE 
incompatíveis com DCE 
H2O, O2 
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC 
Cromatografia Gasosa 
Requisitos - Gás de arraste (FM) 
CUSTO: Gases de 
altíssima pureza 
podem ser muito 
caros. 
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda 
um gás de arraste específico para melhor funcionamento. 
Seleção de Gases de 
Arraste em Função 
do Detector: 
He , H2 DCondTérm 
DIC N2 , H2 
DCaptEletron N2, Ar + 5% CH4 
C
U
S
T
O
 
PUREZA 
A 
B 
C 
A = 99,995 % (4.5) 
B = 99,999 % (5.0) 
C = 99,9999 % (6.0) 
Cromatografia Gasosa 
Injetor 
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou 
VAPORIZADORES) devem prover meios de 
introdução INSTANTÂNEA da amostra na 
coluna cromatográfica 
Cromatografia Gasosa 
Injetor “on column” 
1 
2 
3 
4 
1 - Septo (silicone) 
 
2 - Alimentação de gás de 
arraste) 
 
3 - Bloco metálico aquecido 
 
4 - Ponta da coluna 
cromatográfica 
Cromatografia Gasosa 
Injetor “on column” 
1 2 3 
1 - Ponta da agulha 
da microsseringa é 
introduzida no início 
da coluna. 
2 - Amostra injetada 
e vaporizada 
instantaneamente no 
início da coluna. 
3 - “Plug” de vapor 
de amostra forçado 
pelo gás de arraste a 
fluir pela coluna. 
Cromatografia Gasosa 
Parâmetros de injeção 
Cromatografia Gasosa 
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente 
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem 
decomposição. 
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado 
físico da amostra – não deve ultrapassar a capacidade da 
coluna, determinada pela quantidade de fase estacionária. 
Cromatografia Gasosa 
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L 
êmbolo 
corpo (pirex) 
agulha (inox 316) 
Microsseringa de 
10 L: 
Microsseringa de 1 L 
(seção ampliada): 
corpo 
guia 
êmbolo (fio de aço 
soldado ao guia) 
agulha 
Microsseringas para injeção 
Cromatografia Gasosa 
Colunas 
EMPACOTADA 
 = 3 a 6 mm 
L = 0,5 m a 5 m 
Recheada com sólido pulverizado 
(FE sólida ou FE líquida 
depositada sobre as partículas do 
recheio) 
CAPILAR 
 = 0,1 a 0,5 mm 
L = 5 m a 100 m 
Paredes internas recobertas com 
um filme fino (fração de m) de 
FE líquida ou sólida 
Cromatografia Gasosa 
Programação linear de 
temperatura 
 
 
a) Isotérmico a 45 ºC; 
b) isotérmico a 145 °C; 
c) programado de 30 ºC a 180 ºC 
Cromatografia Gasosa 
Fase Estacionária 
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível 
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) 
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os 
componentes da amostra. 
FE Seletiva: 
separação adequada dos constituintes 
da amostra 
FE pouco Seletiva: 
má resolução mesmo com coluna de 
boa eficiência 
Cromatografia Gasosa 
Fase estacionária sólida 
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação 
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO 
A adsorção ocorre na 
interface entre o gás de 
arraste e a FE sólida 
Cromatografia Gasosa 
Fase estacionária líquida 
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação 
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO 
A absorção ocorre no interior 
do filme de FE líquida 
(fenômeno INTRAfacial) 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal 
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. 
Características ideais: 
1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 
3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias 
ordens de grandeza. 
4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 
400 ºC. 
5. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 
7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 
8. Não destrutivo. 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA 
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. 
REGISTRO 
DE 
SINAL 
ANALÓGICO 
Registradores XY 
DIGITAL 
Integradores 
Computadores 
Cromatografia Gasosa 
Detectores - Funcionamento 
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): 
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por 
eluatos altamente eletrofílicos. 
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU 
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. 
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): 
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de 
H2 + ar. 
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação 
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por 
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de 
moléculas com N e P. 
Cromatografia Gasosa 
Detectores – Limites de detecção 
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): 
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos 
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 
a 1 pg com linearidade até ng. (104) 
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU 
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. 
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104). 
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): 
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha 
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. 
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108). 
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico. 
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg 
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105) 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
UNIVERSAIS: 
Geram sinal para 
qualquer 
substância eluída. 
SELETIVOS: 
Detectam apenas 
substâncias 
com determinada 
propriedade 
físico-química. 
ESPECÍFICOS: 
Detectam 
substânciasque 
possuam 
determinado 
elemento 
ou grupo funcional 
em suas 
estruturas 
DCT DCE DNP 
Cromatografia Gasosa 
Detectores – Espectrometria de massas 
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos 
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o 
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância 
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. 
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de 
determinada razão m/z. 
Detecção 
Universal 
Similar a DCT 
Seletivo 
Maior Sensibilidade 
Cromatografia Gasosa 
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. 
TEMPO 
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 MASSA / CARGA 
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 Cromatograma de íons totais: 
Em cada posição do 
cromatograma tem-se 
um espectro de massa. 
Detectores – Espectrometria de massas 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE 
 • Emprega pequenas colunas (entre 10 e 50 cm); 
 
• A fase móvel é eluída sob altas pressões; 
 
• As colunas são eficazes, mas oferecem uma grande 
resistencia à vazão da fase móvel (sistemas de bombas 
de alta pressão – até 400 bars); 
 
• Microsseringa (para injeção até 50 bar) e válvula de 
injeção (injeção a alta pressão). 
 
• Requer somente que a amostra seja solúvel na fase 
móvel. 
 
• Permite a separação de compostos instáveis a baixas 
temperaturas. 
Cromatografia Líquida 
 
• A capacidade da coluna é determinada pelo seu 
comprimento, diâmetro e material de recheio; 
 
• A quantidade de amostra deve ser pequena, o que exige 
um detector muito sensível; 
 
• Quando se quer separar e recuperar os componentes de 
uma amostra em quantidade suficiente para depois 
serem utilizados – separação do tipo preparativa; 
 
 
 
Cromatografia Líquida 
 • Reservatório da fase móvel 
 
• Recipientes de vidro, aço inoxidável ou plásticos inertes, 
com 1 a 3 litros de capacidade; 
 
• Deve-se filtrar a fase móvel antes de colocá-la no 
reservatório; 
 
• É necessário remover da fase móvel os gases dissolvidos 
(aplicar vácuo dentro do reservatório e agitar a FM 
magneticamente, ou então, colocar a FM sob a ação de 
ultra-som e/ou aquecimento); 
 
OBS: As FM polares tem grande tendência de 
dissolverem oxigênio e outros gases, formando bolhas 
dentro do equipamento, o que pode afetar seriamente 
o funcionamento do detector e a eficiencia da coluna. 
 
 
 
Cromatografia Líquida 
 
• Medidor e controlador de pressão – a P é 
dependente da permeabilidade da coluna, da 
viscosidade da FM, do diâmetro das partículas da 
FE e do comprimento da coluna. 
 
• Controle da temperatura da coluna e detector 
 
• A maioria das análises são realizadas a T 
ambiente – só tem controle de T da coluna em 
cromatografia por troca iônica ou por exclusão 
• Controle de T do detector depende do tipo 
empregado. 
 
 
 
 
Cromatografia Líquida 
 
• Desvantagens: 
 
• Custo do equipamento; 
• Custo dos reagentes; 
• Custo da coluna; 
• Sensibilidade menor em relação a CG; 
• Resolução menor em relação a CG; 
• Tem que purificar a amostra. 
Cromatografia em fase líquida 
Cromatografia Líquida 
Programação da fase móvel-consiste em trocar a fase móvel 
 conforme transcorre a análise 
Eluição isocrática em HPLC = mesma composição da FM durante a eluição. 
 
Cromatografia Líquida 
 • Características das fases móveis usadas em 
CLAE 
 
• Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação; 
• Dissolver a amostra sem decompor os seus 
componentes; 
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária; 
• Ter baixa viscosidade; 
• Ser compatível com o tipo de detector utilizado; 
• Ter polaridade adequada para permitir uma 
separação conveniente dos componentes da amostra. 
 
Componentes típicos - CLAE 
Cromatografia Líquida 
Pré-coluna (2 a 5 cm) 
•Remoção de material particulado 
•Contaminantes do solvente 
•Contaminantes da amostra 
•Saturar a FM com a FE (qdo usar 
cromatografia líq-líq) 
Aumenta a vida útil da coluna 
Cromatografia Líquida 
Colunas para CLAE 
COLUNAS TÍPICAS 
•Material: aço inox 
•Comprimento: 10 a 30 cm 
•Diâmetro: 4 a 10 mm 
•FE: Partículas de 5 a 10 m 
Extremos-Disco de teflon ou metal poroso 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
 As características desejáveis para os detectores 
para CLAE não são diferentes daquelas para CG. 
 
 Existem vários tipos:índice de refração, por 
espectrometria UV-visível, por fluorescência, eletroquímico, por 
condutividade elétrica). 
 
Características ideais: 
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de 
grandeza. 
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 
6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 
7.Não destrutivo. 
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão. 
Cromatografia Líquida 
Técnicas de CLAE 
•Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção; 
•Cromatografia líquido-líquido ou por partição; 
•Cromatografia líquida com fase ligada; 
•Cromatografia por exclusão; 
•Cromatografia por troca iônica. 
•Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa. 
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água) 
 FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) 
 O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel 
na fase móvel. 
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) 
 FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) 
 O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da 
polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição. 
Cromatografia Líquida 
Campo Misturas típicas 
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, 
analgésicos 
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios 
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, 
aflatoxinas, aditivos, aminoácidos, 
pigmentos, açúcares, entre outros. 
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, 
propelentes, corantes industriais 
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas 
policloradas) 
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, 
narcóticos 
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, 
extratos de urina, estrógenos 
Fator CG CLAE 
Requisitos para amostra Amostra ou derivado volátil, 
termicamente estável na T de operação 
do sistema cromatográfico. 
Amostra solúvel na fase móvel 
Tipos de amostra Gases, líquidos e sólidos:MM: 2 a 1200; 
(mais comum de 100-500). 
Líquidos e sólidos, iônicos ou 
covalentes. MM: 32 até 4.000.000. 
Quntidades mínimas detectáveis 10-12ga, ou 1ng ou 100 pg 10-9 gb 
Tempo de análise Minutos até poucas horas Minutos até muitas horas 
Pratos teóricos por coluna 2.000-300.000/metro 500-25.000 
Capacidade preparativa Pobre até razoável, usando-se múltiplas 
injeções 
Boa, com facilidade de coleta e 
capacidade de automatização 
Capacidade analítica Excelente. Separação de amostras com 
até 200 componentes 
Excelente. Separação de até 50 
componentes numa amostra 
Tempo de treinamento p/ um operador se 
tornar proficiente 
Cerca de 3 meses Pelo menos 6 meses 
Comparação entre as características de CG e da CLAE. 
a Detector por ionização em chama ou por captura de elétrons. 
B Detector por absorvância do UV. 
Cromatografia líquida 
Exemplo de cromatograma 
F I M