Estudo Dirigido - Leishmania completo

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Estudo Dirigido 
Leishmania sp
O gênero Leishmania é classificado em 3 sub-complexos: complexo Leishmania braziliensis, Leishmania mexicana e Leishmania donovani. Apoiado em que aspecto é baseada essa classificação? 
Esta classificação proposta por Lainson e Shaw (1972) é baseada em critérios extrínsecos do parasito, tais como forma clínica, seu comportamento em cultura, a patologia apresentada em animais de laboratório, a localização do vetor e lugar de onde o parasito foi isolado. Atualmente, consideram-se as características clínicas e epidemiológicas para a classificação das espécies, apoiada por aspectos biológicos, bioquímicos e moleculares.
Esquema do professor em aula
Leishmaniose cutânea 	( 	L. braziliensis e L. amazonensis
Leishmaniose Visceral 	( 	L. infantum/chagasi (ambas semelhantes molecularmente).
Lembrando que uma espécie que comumente causa leishmaniose cutânea poderia, por exemplo, causar a visceral, ou o contrário.
Como é organizado o genoma dos parasitos do gênero Leishmania?
Os parasitos do gênero Leishmania possuem genoma com tamanho de mais de 32 milhões e 800 mil pares de bases. Nesse genoma haploide de 36 cromossomos é predita a existência de 911 genes de RNA, 39 pseudogenes e 8272 genes codificadores de proteínas, onde estão genes envolvidos na interação patógeno-hospedeiro como síntese de enzimas proteolíticas e glicoconjugados de superfície.
Comparação do genoma de Leishmania com seres mais evoluídos ( Quanto menos evoluído o organismo, menor a quantidade de mb, menor o tamanho de seu genoma.
Se o genoma dos parasitos do gênero Leishmania é bem conservado, o que distingue as espécies do gênero? Por que os genes do parasito são importantes para determinar qual a forma clínica da leishmaniose será desenvolvida após a infecção?
Embora similares, as sequências genômicas dos parasitos do gênero Leishmania apresentam genes com distribuição variada entre as espécies. Este é um número pequeno, levando em consideração a relação de aproximadamente 200 genes variados em um genoma com mais de 8000. A formação dos diferentes genomas se dá pela formação de pseudogenes e perda de genes. 
Estes genes com distribuição variada entre as espécies codificam proteínas relacionadas com a interação patógeno-hospedeiro e a sobrevivência do parasito dentro do macrófago; fatores importantes para o desenvolvimento das diferentes formas clínicas da leishmaniose.
Diferenças nesses genes ( Abertura para estudos no desenvolvimento de vacinas e tratamentos.
Porém, reforçar o conhecimento de que a doença é resultante da diferença molecular do parasito e da resposta imune do indivíduo infectado.
Como se dá a transcrição dos genes e a regulação gênica nos parasitos do gênero Leishmania?
Nestes organismos os genes codificadores de proteínas são organizados em blocos em uma mesma fita de DNA, não possuem íntrons (com exceção do gene da Poli-A polimerase) e são transcritos de forma policistrônica a partir de sequencias promotoras não definidas. Esses policístrons formam m - RNA monocistrônicos maduros através do mecanismo de processamento em “TRANS” splicing que difere do “CIS” splicing, típico da maioria dos eucariotos. A regulação é feita em nível pós-transcricional.
Esquema do professor em aula
Íntrons ( não são transcritos, passíveis de sofrer splicing.
Éxons ( transcritos em RNA.
A dificuldade no splicing de DNA da Leishmania ocorre por esta não possuir muitos íntrons, devido ao tamanho de seu genoma.
Regiões policistrônicas ( regiões com várias áreas repetidas, ocorre a produção de vários RNA de uma só vez para menor gasto de energia pela célula.
Regulação ( 	DNA 		( 	RNAm 	( 	Proteínas
		 (Bactérias)	 (Leishmania)	 (Humano)
No TRANS-splicing ocorre a quebra apenas nos éxons ( Importância no desenvolvimento de medicações e vacinas
Outros organismos podem realizar CIS-splicing, onde ocorre quebra tanto em íntrons quanto éxons.
Qual o perfil de citocinas observado nas diversas formas clínicas das leishmanioses tegumentar e visceral?
O perfil das citocinas observadas nas formas clínicas da leishmaniose demonstra a íntima relação existente entre o perfil da resposta imune e o desenvolvimento de diferentes quadros clínicos. Na leishmaniose tegumentar (leishmaniose cutânea localizada, leishmaniose mucosa e leishmaniose cutânea difusa) o tipo de resposta celular – th1 ou th2 – está diretamente relacionado com a manifestação da doença. Por exemplo: na leishmaniose cutânea localizada e mucosa são observadas citocinas do tipo TH1 (IFN-γ, IL-12, IL-2 e TNF-α), envolvidas principalmente na eliminação de patógenos intracelulares. Na leishmaniose cutânea difusa o perfil predominante é uma resposta TH2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13), as citocinas estando envolvidas principalmente na eliminação de patógenos extracelulares, como os helmintos. Na forma visceral observa-se um balanço nas respostas TH1 e TH2, com altos níveis plasmáticos de IL-8, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-12 e IL-10. Com elevados níveis plasmáticos de IFN-γ, IL-12, IL-10 e TGF-β durante a forma ativa da doença.
Esquema do professor em aula
Tegumentar 		Difusa (nodular) ( Th2 (IL4, IL5, IL10) *Produção de anticorpos
			Localizada ( Th1 (IFN-(, TNF-α, IL2, IL12)
			Mucosa ( Th1 e Th2
Visceral ( Th1 + Th2 *Produção de anticorpos
*A resposta por anticorpos não é ideal, pois o parasito está dentro dos macrófagos.
Tendo como base o conhecimento sobre imunopatogênese das leishmanioses cutânea e mucosa, como você proporia uma manipulação da resposta imune para o tratamento dessas doenças? 
A ineficiência da resposta celular em destruir completamente as Leishmanias e a forte resposta Th1 que leva a uma reação inflamatória intensa e, consequentemente, danos aos tecidos próprios, resulta em aparecimento de úlceras na pele e na mucosa. Sabendo que o IFN-γ potencializa a resposta celular e o TNF-α está relacionado com os danos teciduais, a administração de IFN-γ e droga inibidora de TNF-α podem apresentar resultados satisfatórios no tratamento.
Em uma resposta aumentada, com grande inflamação ( administração de interleucinas (IL10) para que ocorra equilíbrio com a resposta Th1.
De que maneira o protozoário Leishmania escapa da resposta imune inata?
Observações em sala de aula
Resposta inata ( fagocitose do parasito.
Pessoas com macrófagos eficientes respondem melhor à doença. Uma resposta imune inata eficaz é muito importante, pois facilita a resposta imune adquirida (apresentação do antígeno pelos macrófagos).
Qual é o local onde ocorre a primeira interação do parasito Leishmania e o sistema imune do cão, ocasionando um acúmulo maior de formas amastigotas? Em relação a este local, quais os sintomas mais comuns?
Observações em sala de aula
Cães com maior quantidade de amastigotas ( desenvolvimento acentuado na base do folículo piloso. Grandes inflamações, alopecia nestes locais, crescimento acentuado das unhas, queratinização do focinho e “coxinhos” do animal, crescimento de tecido epitelial alterado nas extremidades das orelhas, descamação ao redor dos olhos e orelhas, perda de peso acentuada.
Quais são os testes recomendados pelo Ministério da Saúde no diagnóstico para leishmaniose? Qual a problemática enfrentada no diagnóstico para Leishmania nos cães assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos?
Observações em sala de aula
(FIOCRUZ, 2011) Recomendação de ELISA e RIFI. Na técnica de ELISA podem ocorrer respostas cruzadas (babesiose, erliquiose). Diluição 1:40.
(2011, 2013) Imunocromatografia (DPP) para triagem. Técnica mais usada pelo baixo custo, resposta rápida, amostra pequena (apenas 1 gota de sangue é necessária), possibilidade de uso em campo. Confirmação com ELISA.
Melhor diagnóstico é a técnica de PCR, porém tem alto custo e há uma necessidade de padronização.
Os testes não diferenciam a presença de anticorpos de infecção ativa ou provenientes de vacinação.
	Quais os medicamentos empregados notratamento da leishmaniose? E quais os problemas que os pacientes enfrentam com esse tipo de tratamento?
O antimonial tártaro emético foi a droga utilizada por muitos anos no Brasil para tratar a Leishmaniose Tegumentar Americana. Atualmente utiliza-se o glucantime e Pentostan. Estudos revelam que pode-se realizar associação de fármacos no tratamento utilizando alopurinol, aminosídeos, entre outros, em caso de Leishmaniose Visceral. Pode-se utilizar também para LV a anfotericina B, bem como cetoconazol e itraconazol. Os problemas que os pacientes enfrentam com o tratamento são pancreatite, toxicidade cardíaca e insuficiência renal. Todos estes problemas estão ligados à toxicidade do fármaco e muitas das vezes é necessário suspender o tratamento. Há pacientes que vão a óbito devido ao tratamento, e não pela parasitose. 
Tratamentos não são completamente eficientes, havendo a possibilidade de criar-se resistência aos medicamentos utilizados.
 Quais as providências legais a serem tomadas quando a doença é detectada em cães? Há algum tipo de tratamento?
PORTARIA INTERMINISTERIAL Nº 1.426 DE 11 DE JULHO DE 2008.
Proíbe o tratamento de leishmaniose visceral canina com produtos de uso humano ou não registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
O MINISTRO DE ESTADO DA SAÚDE E O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso das atribuições que lhes confere o inciso II do parágrafo único do art. 87 da Constituição, e
Considerando as normas do “Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral” do Ministério da Saúde;
Considerando que não há, até o momento, nenhum fármaco ou esquema terapêutico que garanta a eficácia do tratamento canino, bem como a redução do risco de transmissão;
Considerando a existência de risco de cães em tratamento manterem-se como reservatórios e fonte de infecção para o vetor e que não há evidências científicas da redução ou interrupção da transmissão;
Considerando a existência de risco de indução a seleção de cepas resistentes aos medicamentos disponíveis para o tratamento das leishmanioses em seres humanos; e
Considerando que não existem medidas de eficácia comprovada que garantam a não-infectividade do cão em tratamento,
 
R E S O L V E M:
Art. 1º Proibir, em todo o território nacional, o tratamento da leishmaniose visceral em cães infectados ou doentes, com produtos de uso humano ou produtos não-registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).
Art. 2º Definir, para efeitos desta Portaria, os seguintes termos:
I - risco à saúde humana: probabilidade de um indivíduo vir a desenvolver um evento deletério de saúde (doença, morte ou sequelas), em um determinado período de tempo;
II - caso canino confirmado de leishmaniose visceral por critério laboratorial: cão com manifestações clínicas compatíveis com leishmaniose visceral e que apresente teste sorológico reagente ou exame parasitológico positivo;
III - caso canino confirmado de leishmaniose visceral por critério clínico-epidemiológico: todo cão proveniente de áreas endêmicas ou onde esteja ocorrendo surto e que apresente quadro clínico compatível de leishmaniose visceral, sem a confirmação do diagnóstico laboratorial;
IV - cão infectado: todo cão assintomático com sorologia reagente ou parasitológico positivo em município com transmissão confirmada, ou procedente de área endêmica. Em áreas sem transmissão de leishmaniose visceral é necessária a confirmação parasitológica; e
V - reservatório canino: animal com exame laboratorial parasitológico positivo ou sorologia reagente, independentemente de apresentar ou não quadro clínico aparente.
O CFMV esclarece que o médico veterinário que tratar animais com leishmaniose e for flagrado ou denunciado está sujeito à abertura de processo ético (Resolução CFMV 875/2007). Se condenado terá penalidades como advertência, censura confidencial, censura pública, suspensão por até 90 dias ou cassação do registro profissional de acordo com o Artigo 33 da Lei 5.517/68.
NOTA DE ESCLARECIMENTO CFMV
Diante da decisão do Tribunal Regional Federal da 3ª Região (TRF 3) que declarou a nulidade da Portaria interministerial dos ministérios da Saúde e Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa), Portaria n° 1.426/2008, que proíbe o tratamento de cães com Leishmaniose Visceral Canina por meio de produtos de uso humano ou de medicamentos não registrados pelo Mapa, o Conselho Federal de Medicina Veterinária esclarece:
O tratamento da Leishmaniose Visceral em animais oferece risco à saúde da população;
O tratamento não promove a cura da doença e o animal contaminado continua sendo hospedeiro e fonte de contaminação por meio do mosquito transmissor;
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), somente a adoção de medidas integradas, como o uso de inseticidas e a eutanásia dos cães contaminados, é que poderá garantir a segurança da população e da saúde humana.
Portanto, até que a cura para a doença seja cientificamente comprovada, o posicionamento institucional do CFMV e dos Conselhos Regionais é pelo não tratamento da doença, garantindo assim a segurança e proteção à saúde pública, em conformidade com a legislação federal, Decreto n° 51.838/1963, código penal e recomendações sanitárias.
Nos últimos 11 anos, a Leishmaniose Visceral causou mais mortes que a dengue em nove estados brasileiros. A doença, que antes era limitada a áreas rurais e à Região Nordeste, hoje encontra-se em todo o território nacional. Um levantamento realizado com base em números do Ministério da Saúde aponta que a Leishmaniose provocou 2.609 mortes em todo o País, entre 2000 e 2011. 
A decisão judicial a que me refiro tinha ocorrido no sentido de dizer que o Médico Veterinário não tinha nenhum impedimento para prescrever medicamentos da linha humana para serem usados em animal. No entanto, jamais a Justiça autorizou o tratamento da Leishmaniose, como inúmeras pessoas interpretaram, tomando o posicionamento como verdade. Surge agora a decisão sobre o mérito, o que significa dizer que a liminar foi cassada e revigorada a Portaria 1426/2008, do MS/MAPA. 
“No caso dos autos, vislumbro situação emergencial, que diz respeito à saúde pública em toda sua gravidade. Não obstante a existência de vários artigos científicos juntados aos autos, tem máxima relevância material científico recente (de 06/06/2013), oriundo da Unidade de Parasitologia da Universidade de Lisboa, apontando a existência de crescente resistência ao medicamento utilizado para combater a leishmaniose humana e que vem sendo utilizado para tratar a mesma doença em cães,”
Na decisão proferida pelo Desembargador Federal consta o que se segue:
“A perspectiva de legitimar, ainda que limitadamente, em casos específicos (é bom frisar esta especificidade) a eutanásia canina desagrada a qualquer um que tenha um mínimo de sensibilidade. Entretanto, a situação é grave: em Campo Grande/MS temos foco da doença e não podemos deixar que, ainda que em tese, se vislumbre a possibilidade de morte de seres humanos por ineficiência medicamentosa em razão do uso do remédio em cães. A mortalidade da doença, nesta cidade, alcança assustadores 8% da população humana infectada e, repita-se, diante do estudo atualizado e que subsidia a corporificação de uma situação de risco para a saúde destas pessoas doentes, impõe-se uma medida judicial que coacte o perigo evidente.”
Finaliza:
“Por estes motivos, DEFIRO PARCIALMENTE o pedido de suspensão da decisão ora recorrida, permitindo a utilização da Portaria 1426/2008, desde que a eventual eutanásia canina a ser praticada seja precedida da realização dos dois testes acima mencionados e também antecedida de criteriosa avaliação do Médico-Veterinário pertencente aos quadros públicos.”
Tribunal Regional Federal da 3a Região, em São Paulo, da decisão que declarou a ilegalidade da Portaria Ministerial 1426/2008-MAPA, que proibia a utilização de produtos de uso humano ou não registradosno Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para o tratamento de cães infectados pela leishmaniose visceral.
A decisão da Justiça Federal entendeu que a Portaria extrapola os limites da legislação que regulamenta a garantia de livre exercício da profissão de médico veterinário, assim como das leis de proteção do meio ambiente.
Na decisão, a Justiça Federal reconhece que ‘ao veterinário é que cabe decidir acerca da prescrição do tratamento aos animais, bem como quanto os recursos humanos e materiais a serem empregados’. A Portaria, ao vedar a utilização de produtos de uso humano ou não registrados no competente órgão federal viola os referidos preceitos legais e, por consequência, indiretamente, a liberdade de exercício da profissão, prevista no inciso XIII do artigo 5º da Constituição Federal, assim como o princípio da legalidade, que consta do inciso II.
(Fonte: RBV News)
 Você concorda com o tratamento de cães infectados? Sim ou Não? Por quê? E quais as medidas preventivas e de tratamento de cães que estão disponíveis no mercado?
Não concordo com o tratamento. A maioria dos animais após o tratamento tornam-se assintomáticos, mas permanecem reservatórios da doença, uma vez que em casos de imunossupressão a parasitemia retorna, passando a ser um potente foco de infecção para humanos, quando na presença do flebotomíneo.
Drogas usadas no tratamento	
Antimoniais
Antimoniato de n-metil glucamina (Glucantime)
Estibogluconato de sódio (Pentostam)
Seu mecanismo de ação ainda não é totalmente claro e parecem agir bloqueando a atividade enzimática dos parasitos, tendo um efeito leishmanicida. Sua toxicidade pode ser comparada a dos antibióticos aminoglicosídeos.
Diamidinas
Pentamidina (Lomidine)
Seu mecanismo de ação consiste em provocar uma alteração no metabolismo do parasito, agindo sobre as mitocôndrias, o cinetoplasto, a bolsa flagelar e os ribossomas, com efeito leishmanicida. São mais tóxicas que os antimoniais pentavalentes, possuem menor eficácia e exigem maior tempo de terapia.
Antibióticos derivados dos Polienos
Hiamicina/ Sinefungina/ Nistatina/ Anfotericina B
Agem interrompendo as membranas celulares dos microrganismos, provocando a morte dos protozoários. São fortemente tóxicas.
Antibióticos aminoglicosídeos
Paranomicina/aminosidina
Mecanismo de ação desconhecido, sinergia com antimoniais, possui toxicidade relativa.
Derivados do Imidazol
Metronidazol (Flagyl)/ Secnidazol (Flagentil)/ Cetoconazol (Panfugol).
Possuem mecanismo de ação semelhante ao da Anfotericina B, são relativamente pouco tóxicos, apresentam resultados irregulares e mais estudados na terapia da leishmaniose cutânea
Análogos das Purinas
Pirazolopirimidinas principal droga alopurinol (Zyloric)
Tem ação leishmaniostática, sinérgico com drogas leishmanicidas, são em geral pouco tóxicas.
Medidas preventivas
Todas as formas de prevenção devem ser tomadas tanto no ambiente, quanto no animal e no homem. Os cuidados com o meio ambiente visam diminuir a reprodução do flebotomíneo. Essa é a forma mais eficaz de combate. Em casas, são indicadas telas bem fechadas nas janelas e portas. Onde houver grande quantidade de mosquitos ou casos de contaminação em humanos ou cães por leishmaniose, recomenda-se a dedetização do local com inseticidas do tipo piretróides.
Cães: Vacinação – Leishmune® ou LeishTec®
Coleira antiparasitária: Scalibor®
 Quais as vantagens do PCR em tempo real para o diagnóstico para Leishmania, comparando com o convencional?
O PCR consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. É o método para rápida amplificação de sequências específicas de DNA. A localização da sequência alvo é feita pelos iniciadores, que são oligonucleotídeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade. Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita, isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas. 
 O PCR convencional não apresenta valores quantitativos, por isso foi desenvolvido o PCR em tempo real, que é uma técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas a cada ciclo. As características relevantes do PCR em tempo real são rapidez, especificidade, sensibilidade e quantificação. A amplificação é dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência, a fase log em que a quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo e a fase platô onde não há mais aumento no número de produtos. Com PCR convencional os resultados são qualitativos. Um baixo nível de DNA medido pode ou não pode ser detectado, dependendo da sensibilidade do equipamento e tecnologia, bem como o treinamento da pessoa a realizar o teste. 
A PCR em tempo real consegue detectar cargas parasitária muito baixas, reduzindo a quantidade de falso negativo.
Em comparação com PCR em tempo real, o PCR convencional demanda mais tempo e apresenta dados apenas qualitativos. Nos ensaios com PCR em tempo real, os produtos da reação são analisados no momento da realização da ciclagem e os resultados são tanto qualitativos como quantitativos. Esta técnica vem sendo utilizada por diversos autores, em amostras provenientes de cães e de humanos, possibilitando a realização de estudos relacionados à carga parasitária, interação hospedeiro-parasito e monitoramento da terapia.
Qual a relação entre a ocorrência da leishmaniose e os fatores socioeconômicos? E quais são os países endêmicos para a doença?
Muitas das vezes a ocorrência da leishmaniose está ligada à ação do homem em decorrência do desmatamento e destruição de florestas onde estas serão ocupadas por centros urbanos. O mosquito e o parasito vão para a proximidade do homem e assim promovem a disseminação da doença. Há fatores como a presença de cães abandonados nas cidades; estes servem de reservatório para o parasita e assim disseminam a doença. Ela está presente em países tropicais, podendo ser encontrada na África, Índia, Nepal, Sudão, Brasil, Argentina, Bolívia, Colômbia, Paraguai, Venezuela entre outros.