Apostila de Bioquímica - Prática

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1a AULA
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO E SOLUÇÕES
INSTRUÇÕES
1.	Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para brincadeiras.
2.	Leia os guias das práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das aulas.
3.	Realize somente os experimentos indicados na aula. Não é permitido realizar aqueles não autorizados.
4.	Tendo qualquer dúvida solicite aos professores os devidos esclarecimentos.
5.	Compareça às aulas nos dias e nos laboratórios designados para sua turma.
6.	Não é permitido fumar ou consumir alimentos durante as aulas práticas.
7.	Para sua própria segurança, vista um guarda-pó (avental) ao entrar no laboratório.
8.	Não troque os reagentes de uma mesa para outra.
9.	No final de cada aula, limpe todo o material: Passe água de torneira nos tubos e outros materiais utilizados. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas. 
10.	Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique aos professores.
11.	Se engolir um pouco de ácido, lave rapidamente a boca com bastante água e em seguida
com solução de carbonato de sódio 2%.
PRINCÍPIOS DE TÉCNICA
a.	Pipetas graduadas, não devem ser sopradas ao fim do escoamento. Portanto recomenda-se empregar o começo (o zero) e não o fim da graduação para dispensar volumes pequenos.
b.	Uma mesma pipeta não pode ser usada para medir soluções diferentes a não ser que seja lavada.
c.	Nunca aquecer material volumétrico.
d.	Antes de retirar de um frasco uma solução qualquer, ler o rótulo.
e.	Para aspirar soluções de ácidos e álcalis concentrados, usar uma pipeta de segurança (pera), antes testada com água.
f. 	Nunca devolver uma solução para o frasco estoque.
UNIDADE DE VOLUME
A unidade fundamental de volume na medida de líquidos é o litro (l) e o mililitro (ml) é o seu submúltiplo, correspondente à milésima parte do litro. 
MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATÓRIO
VIDRARIA - De um modo geral, encontramos num laboratório de Química dois tipos de material de vidro, volumétrico e não volumétrico. Dentre os volumétricos temos: pipetas, provetas e balões volumétricos.
PIPETAS - São destinadas a transferir determinados volumes de líquido. Há dois tipos: graduados e volumétricos. Nestas práticas, só pipetas graduadas são usadas. Elas têm volumes de 1, 2, 5 e 10 ml e permitem escoar volumes variáveis de líquido, de acordo com a sua graduação, dividida em décimos ou centésimos de ml.
PROVETAS - (Cilindros graduados) - São de medida volumétrica não muito rigorosa, graduadas para diversos volumes de líquido: 25, 50, 100, 250 ... ml.
BALÕES VOLUMÉTRICOS - São balões aferidos a fim de conterem um volume determinado por um traço de referência (50, 100, 250, 500 ... ml). São usados no preparo de soluções que exijam grande exatidão na sua concentração. No entanto, para esta exatidão ser garantida, todas as operações de preparo de soluções devem ser feitas na temperatura do aferimento do material volumétrico, geralmente 20o C.
MATERIAL NÃO VOLUMÉTRICO 
	Os principais tipos de vidraria utilizados nestas práticas são: tubo de ensaio, béquer, erlenmeyer e funil. São também freqüentemente usados estantes e pinças para tubos de ensaio.
TÉCNICA DE LEITURA DE MATERIAL VOLUMÉTRICO
	Faz-se pela observação da coincidência entre a curvatura que se forma na superfície livre do líquido (menisco) e a graduação existente no material volumétrico. A parte inferior do menisco deve coincidir com o traço de graduação correspondente ao volume desejado. Para evitar erro, sua vista, o menisco e o traço de graduação devem estar num mesmo plano horizontal.
VELOCIDADE DE ESCOAMENTO
	
	Se o escoamento for muito rápido (soprando na pipeta, por exemplo), a quantitade de líquido que resta na pipeta aderido às paredes será maior do que a que deve ficar. Com água, considera-se o que o tempo mínimo para o escoamento total de pipetas de 1 ml e 5 ml deve ser de 15 segundos.
EXPERIÊNCIAS
Treinamento com pipetas - Procure identificar as pipetas de diferentes capacidades e graduações (1, 2, 5 e 10 ml) que estão em sua bancada. Faça então os exercícios seguintes, começando com uma pipeta de 10 ml:
	
	Introduza a extremidade inferior da pipeta em água destilada contida em um béquer. Aspire com a boca até que o nível da água ultrapasse o traço superior da aferição (zero). Tire rapidamente a boca da abertura da pipeta e obture a mesma com o indicador da mão direita. Diminua a pressão exercida pelo indicador sobre a abertura, de modo a deixar a água cair gota a gota, até que a parte inferior do menisco coincida com o zero (mantendo a pipeta na vertical e a marca no nível dos olhos). Acertado o zero, comece então a escoar lentamente volumes variáveis (10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml), acertando a cada vez o menisco no zero.
REPITA O EXERCÍCIO
	Com uma pipeta de 5 ml, escoando: 5 ml - 4 ml - 3 ml - 2 ml.
	Com uma pipeta de 2 ml, escoando: 2 ml - 1,7 ml - 1,5 ml - 1 ml.
LEMBRE-SE
	Volumes compreendidos entre 10 e 5 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 10 ml, volumes entre 5 ml e 2 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 5 ml, volumes entre 2 e 1 ml com uma pipeta de 2 ml e volumes entre 1 e 0,1 ml com uma pipeta de 1 ml.
SOLUÇÕES
	
	As principais maneiras de definir a concentração de uma solução são através da percentagem, da molaridade ou da normalidade.
	Uma solução percentual contém uma quantidade medida do soluto numa determinada quantidade do solvente. Os três principais tipos de soluções percentuais resultam da definição destas quantidades por peso ou por volume:
	1 - Solução percentual peso por volume - % p/v - Ex.: solução de cloreto de sódio 	2% (2 g do sal em 100 ml da solução)
	2 - Solução percentual peso por peso - % p/p - Ex.: solução de ácido clorídrico 	37% (37 g do ácido em 100 g da solução)
	3 - Solução percentual volume por volume - % v/v - Ex.: solução de ácido acético 	5% (5 ml do ácido em 100 ml da solução)
	Uma solução molar é aquela que contém o peso molecular do soluto em gramas, por litro de solução. É representada por 1 M ou M. Pode haver múltiplos ou submúltiplos do peso molecular : 2 M - 4 M - 0,1 M - 0,2 M etc. Uma solução M de cloreto de sódio contém 58,5 g (p.m.) do sal, em um litro. Uma solução 2 M conterá 2x58,5g = 117 g. Uma solução 0,1 M conterá 5,85 g.
	
	Soluções normais são aquelas que contém um equivalente-grama do soluto por litro de solução. Podemos ter múltiplos e submúltiplos do equivalente-grama: 1 N, 2 N, 0,1 N... O cálculo do equivalente-grama depende da natureza química do soluto. Se um ácido, calcula-se dividindo o peso molecular pelo número de átomos de H ionizáveis. Ex.: sol. HCl 1 N (36,5 g/l); sol. HCl 0,1 N (3,65 g/l); sol. H2SO4 1 N (98/2 = 49 g/l).
EXPERIÊNCIA - PESAGEM E PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO
	Preparar 25 ml de uma solução de cloreto de sódio 20 % p/v.
TÉCNICA
	Coloque todos os pesos da balança em zero.
	O ponteiro deve estar no centro, posição de equilíbrio.
	Sobre o prato coloque um béquer. Observe que o ponteiro deslocou-se para cima. Mova os pesos das escalas até restabelecer o equilíbrio. Por exemplo, se o béquer pesou 68 g, o peso da escala de 10/100 g deverá estar em 60 e o da escala 1/10 g em 8.
	Anote o peso do béquer: __________
	
	Ao peso do béquer some a quantidade de NaCl necessária para se preparar 25 ml da solução a 20 % p/v.
	Anote o resultado do cálculo béquer + NaCl: ___________
	Desloque os pesos da balança até obter o total calculado. Observe que o equilíbrio da balança foi desfeito. Para restabelecê-lo, adicione NaCl ao béquer. Temos assim pesada a quantidade de sal necessária para se preparar os 25 ml da solução a 20%.
	Preparação da solução
	
	Ao cloreto de sódio contido no béquer junte cerca de 10 ml de água destilada. Misture com bastão de vidro até dissolver. Transfira a solução do sal para uma proveta de 25 ou50 ml, tomando cuidado para não perder líquido. Ao béquer adicione 5 ml de água destilada e transfira para a proveta. Complete o volume até a marca de 25 ml com água destilada não deixando ultrapassar a marca.
OBSERVAÇÕES
 	Nas ciências modernas, a tendência é substituir o termo peso por massa.
	As quantidades definidas por volume são sujeitas a alterações significativas pela temperatura. Em ambientes onde a temperatura não pode ser controlada rigorosamente, é recomendável definir todas as quantidades pelas massas.
SOLUÇÕES-TAMPÃO
	Tampões são soluções que resistem a variações de pH. São constituídos de ácidos fracos e seus sais ou de bases fracas e seus sais. Ex.: tampão acetato (ácido acético + acetato de sódio).
MECANISMO DE AÇÃO
	Vamos tomar como exemplo o tampão acetato.
	Se a este tampão se adicionar um ácido forte como o HCl, haverá formação de um sal neutro e de um ácido fracamente ionizado, e o pH da solução permanecerá quase o mesmo.
			CH3COOH			
			CH3COONa + HCl (	 NaCl + CH3COOH
							 (sal neutro) (ácido fraco)
	Se ao mesmo tampão adicionarmos uma base forte como o hidróxido de sódio, haverá formação de acetato de sódio (menos alcalino que o NaOH) e água. Também neste caso o pH quase não se modificou.			
			CH3COOH + NaOH (	CH3COONa + H2O
			CH3COONa 
TAMPÕES FISIOLÓGICOS
	Um dos mecanismos de controle da neutralidade dos líquidos celulares é devido à ação de tampões. Os principais tampões que estabilizam o pH do sangue na faixa de 7,35 a 7,45 são: bicarbonato/ácido carbônico, fosfato e hemoglobina. A manutenção deste pH é importante porque valores de pH acima de 7,7 ou abaixo de 6,8 são incompatíveis com a vida.
EXPERIÊNCIAS COM TAMPÕES
	Distribuir em quatro béquers marcados:
	Béquer 1 e 2: 25 ml de água destilada
	Béquer 3 e 4: 25 ml de sol. tampão acetato 0,1 N pH 5.
	Medir com papel indicador o pH aproximado dos líquidos dos 4 béquers. Anotar o resultado no quadro a seguir.
	Aos béquers 1 e 3 adicionar em cada, uma gota de HCl concentrado.
	Aos béquers 2 e 4 adicionar em cada, uma gota de sol. NaOH 50%.
	Misturar por leve agitação.
	Medir com papel indicador o pH dos líquidos em cada béquer e anotar.
	Béquer
	pH inicial
	pH após HCl
	pH após NaOH
	
	
	
	
	1
	
	
	
	2
	
	
	
	3
	
	
	
	4
	
	
	
	
	
	
	
	
	Baseado nos resultados da tabela, o que concluiu?
�
AMINOÁCIDOS
1. REAÇÃO XANTOPROTÉICA
	
		Pesquisa de Tirosina e Triptofano
	Esta reação é positiva com compostos portadores de radicais aromáticos substituídos.
	Nas proteínas estes radicais aparecem na tirosina e no triptofano.
 Tirosina Triptofano
	Os radicais aromáticos destes aminoácidos reagem com o ácido nítrico formando nitroderivados que em meio alcalino são alaranjados.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substâncias:
	Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
	Ao no 2 - juntar 1 ml de amido
	Ao no 3 - juntar 1 ml de água (tubo controle)
	Adicionar a cada tubo, 10 gotas de ácido nítrico concentrado (muito corrosivo; usar pipeta de 5 ml e apenas com imersão da ponta, não com aspiração). Agitar levemente e colocar no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em água corrente e acrescentar 4 ml de NaOH 2 N. Anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal + o(s) teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:
	Tubo
	Reação
	
	
	1
	
	2
	
	3
	
 	O aparecimento de coloração alaranjada indica a positividade do teste, confirmando a presença dos aminoácidos tirosina e triptofano. Nas condiçoes descritas, a fenilalanina não reage.
2. REAÇÃO DE MILLON
		Pesquisa de tirosina.
	Esta reação é devida a presença do grupo hidroxifenil. Nas proteínas o único grupo deste tipo é encontrado no aminoácido tirosina. O teste de Millon usa como reagente o nitrato de mercúrio, dissolvido numa solução de ácido nítrico. O grupo hidroxifenil produz um fenolato de mercúrio de cor avermelhada.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substâncias:
	Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
	Ao no 2 - juntar 1 ml de fenol 1 %
	Ao no 3 - juntar 1 ml de água (tubo controle)
�
	Adicionar a cada tubo, 5 gotas do reativo de Millon (corrosivo e tóxico). Agitar levemente e colocar no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em água corrente e anotar os resultados em forma de tabela como anteriormente. Que concluiu ?
3. REAÇÃO DO BIURETO
	Reação geral para proteínas.
		Esta reação é denominada “do biureto”porque um composto chamado biureto é o mais simples que apresenta este teste positivo. O biureto é um composto artificial, obtido pelo aquecimento forte de uréia, e tem a seguinte fórmula:
H2N - CO - NH - CO - NH2 
Biureto
		O biureto é o composto mais simples capaz de reagir em meio alcalino com cobre divalente produzindo um complexo de cor violeta. Outros compostos com duas ligações amida dispostas de maneira semelhante ao biureto respondem de maneira semelhante; portanto observamos a reação do biureto principalmente com as proteínas, que têm muitas ligações peptídicas:
 - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO -
Ligações peptídicas
		Os complexos coloridos formados com cobre divalente em meio alcalino têm estruturas parecidas: 
 	Complexo Cúprico do Biureto Complexo Cúprico da Proteína
		A reação das proteínas com o reativo do biureto não é muito sensível, porém é tão segura que ela é usada como referencial para a dosagem da concentração protéica no plasma e soro do sangue humano.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml do reativo do biureto (sulfato cúprico complexado com tartarato em meio alcalino).
	Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
	Ao no 2 - juntar 1 ml de amido
	Ao no 3 - juntar 1 ml de água (tubo controle)
	Misturar por leve agitação dos tubos, esperar 10 minutos, anotar os resultados em forma de tabela.�
PROTEÍNAS
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
	As proteínas podem ser precipitadas de suas soluções por ação de ácidos fortes, por soluções concentradas de sais (p.e. sulfato de amônio), por solventes orgânicos (p.e. álcool) e ainda por sais de metais pesados, em determinadas condições. Ainda que superficialmente parecidas, as reações de precipitação de proteínas podem ter mecanismos muito diferentes. A precipitação de proteínas acompanha-se quase sempre de uma desnaturação das mesmas; no entanto, às vezes esta mudança de conformação é reversível. Por outra lado, existem formas de desnaturação irreversível (p.e. com bases fortes ou detergentes), que não levam as proteínas à precipitação.
1. PRECIPITAÇÃO PELO ÁCIDO TRICLOROACÉTICO
	Ácidos fornecem íons negativos e precipitam as proteínas sob forma de sais; no entanto, este mecanismo vem associado com uma destruição daquelas partes da conformação nativa que dependem de pontes de hidrogênio e de ligações iônicas. A atividade de ácidos particularmente eficientes para precipitar proteínas, como p.e. os ácidos tricloroacético, túngstico e pícrico, explica-se porque estes reagentes atacam, adicionalmente, os centros hidrofóbicos das proteínas.
	TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml de ovoalbumina. Posteriormente, adicionar em cada um as seguintes soluções (cuidado):	
	Ao no 1 - juntar 1 ml sol. ácido acético 20 %
	Ao no 2 - juntar 1 ml sol. ácido clorídrico 20 %
	Ao no 3 - juntar 1 ml sol. ácido tricloroacético 20 %
	Agitar e misturar bem. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando pelo número de sinais + , a quantidade de precipitadoque apareceu.
	Tubo
	Precipitado
	
	
	1
	
	2
	
	3
	
	Que concluiu sobre a eficiência dos diferentes ácidos para precipitar a proteína ? Existe relação entre a molaridade do ácido e o seu efeito sobre a ovoalbumina? 
2. PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS
	 As bases, mesmo fortes, não precipitam as proteínas apesar de elas quebrarem também as pontes de hidrogênio e ligações iônicas. No entanto, o meio alcalino aumenta substancialmente o número de cargas negativas presentes nas proteínas. Nestas condições, reativos como os íons de metais pesados (p.e. mercúrio, chumbo), precipitam as proteínas devido à formação de sais insolúveis (proteinatos) dos metais. (É de se observar que, mesmo em ausência de proteínas, estes metais em condições alcalinas formam hidróxidos, também insolúveis. O precipitado final consiste, portanto, de dois componentes).
			proteina + OH - 	(	proteina –
proteína - + metal +	(	proteinato de metal, insolúvel	
			metal + + OH -		(	metal-OH, insolúvel
�
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 gotas de NaOH (corrosivo; usar pipeta de 5 ml e apenas com imersão da ponta, não com aspiração).
	Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
	Ao no 2 - juntar 1 ml de ovoalbumina e 5 gotas de solução de acetato de chumbo 10 %
	Ao no 3 - juntar 1 ml de água e 5 gotas de solução de acetato de chumbo 10 % 
		 (tubo controle)
	Misturar por leve agitação dos tubos, esperar 10 minutos, e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal - o teste negativo e com um ou vários sinais + , a quantidade de precipitado que apareceu nos testes positivos.
	Tubo
	Precipitado
	
	
	1
	
	2
	
	3
	
	Que concluiu sobre a natureza do precipitado no tubo no 2?
			 
3. PRECIPITAÇÃO POR SATURAÇÃO SALINA E COM SOLVENTE ORGÂNICO
	Muitas proteínas são hidrosolúveis. Todas elas devem sua solubilidade a uma extensa camada de água estruturada que interage com cargas elétricas e resíduos polares na superfície da molécula proteica. A adição de sais (sulfato de amônio) ou solventes misturáveis com água (álcool, acetona) leva a solvatação das respectivas moléculas ou íons, em competição com a proteína, que se torna insolúvel na retirada da sua camada superfícial de água estruturada. No entanto, boa parte desta precipitação é reversível pela adição de mais água, ao contrário das experiências anteriores.
TÉCNICA
	Marcar 2 tubos de ensaio e colocar em cada um 1 ml de ovoalbumina. A seguir, adicionar a estes tubos:
	Ao no 1 - juntar 3 ml de sol. saturada de sulfato de amônio
	Ao no 2 - juntar 3 ml de álcool
	Misturar bem e deixar em repouso antes de anotar os resultados. Depois de 5 min, adicionar a cada tubo, 5 ml de água destilada e misturar outra vez. Na tabela abaixo, utilize um ou mais sinais + para indicar a quantidade de precipitado que apareceu antes e depois da adição de água:
	Tubo
	1O precipitado
	2O precipitado
(após adição de água)
	
	
	
	1
	
	
	2
	
	
 
 	Que concluiu sobre a reversibilidade das precipitações nos tubos 1 e 2 ?
�
4. PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
	O ponto isoelétrico de uma proteína é o valor de pH no qual a molécula apresenta 
carga total nula.
	As proteínas apresentam uma solubilidade mínima nos seus pontos isoelétricos, ou seja, um máximo de precipitacão. Este efeito pode ser demonstrado mais rapidamente em condições que removem parcialmente a proteção fornecida pela camada superficial de água, o que pode ser obtido pela adição de álcool.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml dos seguintes tampões:
	Ao no 1 - solução tampão pH 6,0
	Ao no 2 - solução tampão pH 4,7
	Ao no 3 - solução tampão pH 3,0
	
	A cada tubo adicionar 1 ml de ovoalbumina e 4 ml de álcool. Misturar bem por agitação eficiente. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal + o(s) teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:
	Tubo
	Reação
	
	
	1
	
	2
	
	3
	
	Que concluiu sobre o ponto isoelétrico da ovoalbumina ? Quais aminoácidos ionizados são mais abundantes nesta proteína ?
�
ENZIMAS / UREASE
UREASE (uréia amidohidrolase E.C.3.5.1.5)
	A urease é uma enzima encontrada nas sementes das leguminosas, especialmente no feijão de porco (Canavalia ensiformis), mas também nas sementes da melancia (Citrullus vulgaris). Atua especificamente sobre a uréia transformando-a em CO2 e amônia.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE
		A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de uréia a pH 7, muito fracamente tamponada. A solução contém um indicador, vermelho de fenol (“Vermelho Neutro”), que muda de amarelo para rosa (pH 6,8 a 8,4). Estando a enzima ativa, ocorrerá liberação de NH3 em quantidade suficiente para sobrepujar a ação do tampão tornando o meio da reação alcalino. Como conseqüência da subida do pH, a solução, originalmente amarela, passa à cor rósea.
				 urease
	 uréia + indicador 	 ( 2 NH3 + CO2 + indicador
	(substrato) 	 cor amarela			 (produtos)	 cor rósea
RESUMINDO:	Se a enzima estiver com atividade, ocorrerá mudança de cor de			amarela para rósea. Por que ?
1. TESTE DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
		Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na última coluna, marque com um + ou um - a mudança de cor observada:
	 Tubos
	Uréia tamponada com indicador
	 Urease
	 Água
	
A
G
	 Mudança de cor
	
	
	
	
	I
	
	1
	3 ml
	3 gotas
	-
	T
	
	2
	3 ml
	-
	3 gotas
	A
	
	
	
	
	
	R
	
2. ESPECIFIDADE
		A urease é altamente específica para a uréia. Isto pode ser demonstrado fazendo a enzima reagir com um composto com estrutura semelhante à do substrato, a tiouréia H2N-CS-NH2, e verificar se houve mudança de cor.
		Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na última coluna, marque com um + ou um - a mudança de cor observada:
	
Tubos
	Uréia
tamponada com indicador
	Tiouréia
tamponada com indicador
	
Urease
	
A
G
	 Mudança de cor
	
	
	
	
	I
	
	1
	2 ml
	-
	3 gotas
	T
	
	2
	-
	2 ml
	3 gotas
	A
	
	
	
	
	
	R
	
�
3. DESNATURAÇÃO PELO CALOR
		Devido à sua natureza protéica, as enzimas são sensíveis à ação de temperaturas elevadas, que podem destruir a função catalítica do seu centro ativo.
		Colocar num tubo 3 ml de água destilada e 3 gotas de urease. Agitar. Colocar em banho maria fervente por 3 minutos. Esfriar em água corrente. 
		Em outro tubo pipetar 2 ml de uréia tamponada e juntar 1 ml da urease fervida (tubo anterior). Agitar. Verificar se houve modificação de cor da solução nos próximos 5 minutos. Explicar porque a urease foi diluída antes de esquentar e porque a elevação da temperatura desnatura as proteínas.
4. INIBIÇÃO
		Grupos sulfidrila (SH) próximos ao centro ativo da urease são essenciais para a manutenção da conformação ativa. Compostos como os sais de metais pesados (Hg, Pb, Ag) ao se combinarem com os grupos SH, causam modificações permanentes na conformação da enzima, provocando diminuição e perda de sua atividade:
			enzima - SH + Hg2+ ( enzima - S - Hg+ + H+
		 ativa				 inativa
		Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na última coluna, marque com um + ou um - a mudança de cor observada, após 5 minutos de observação:
	
Tubos
	
Urease
	
Água
	
HgCl2
	Uréia tamponada com indicador
	
A
G
	
Mudança de cor
	
	
	
	
	
	I
	
	1
	3 gotas
	1 ml
	8 gotas
	3ml
	T
	
	2
	3 gotas
	1 ml
	-
	3 ml
	A
	
	
	
	
	
	
	R
	
�
CARBOIDRATOS
1. TESTE DE MOLISCH
	Reação geral para carboidratos.
	A ação desidratante de ácidos concentrados sobre os monossacarídeos leva à formação de furfural e derivados. As aldopentoses formam o furfural e as hexoses produzem o hidroximetilfurfural. Os aldeídos de furano podem se condensar com fenóis e aminas dando compostos coloridos do tipo trifenilmetano. Este é o fundamento da reação que é considerada geral para carboidratos e é conhecida como teste de Molisch. Reagem pentoses e hexoses não apenas como monossacarídeos livres, mas também são positivos no teste todos os compostos que levam carboidratos ligados: polissacarídeos, glicoproteínas, glicolipídeos e outros, que são hidrolisados pelo ácido sulfúrico concentrado. Exemplo:
 5-Hidroximetilfurfural Derivado Trifenilmetano
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos e distribuir neles:
	tubo 1 - 2 ml de sol. glicose 1 %
	tubo 2 - 2 ml de sol. amido 1 %
	tubo 3 - 2 ml de água destilada (tubo controle)
	Aos 3 tubos adicionar 5 gotas de sol. de alfa naftol. Misturar por leve agitação. Pipetar com muito cuidado cerca de 2 ml de ácido sulfúrico (extremamente corrosivo, não aspirar o ácido, usar pipeta de 10 ml) e deixar o ácido escoar lentamente pela parede do tubo sem agitar, a fim de se formar uma camada de ácido por debaixo da solução teste. Sem agitar, colocar o tubo na estante. A reação é positiva quando aparece um anel violeta na interfase. O surgimento de coloração esverdeada na camada inferior é devida a impurezas do naftol. Anotar os resultados em forma de tabela.
2. TESTE DE BIAL
		Reação para identificação de pentoses.
	O mecanismo da reação de Bial (ou reação do orcinol) é semelhante ao da reação de Molisch, ou seja, com ácido concentrado se forma o furfural. A diferença é que neste caso o ácido usado é o ácido clorídrico e o fenol é o orcinol. Consequentemente, o produto formado e sua cor serão diferentes.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos e colocar em cada um, 1 ml do reativo de Bial (HCl com orcinol e FeCl3).
	Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solução de pentose (arabinose)
	Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solução de glicose
	Ao tubo 3 adicionar 1 ml de água destilada (tubo controle)
	Levar os tubos ao banho-maria fervente por 30 segundos e anotar os resultados em forma de tabela. O teste é positivo quando se forma uma coloração esverdeada.
�
3. TESTE DE SELIWANOFF
		Distinção entre aldoses e cetoses.
	Nas condições do teste, as cetohexoses transformam-se nos derivados do furfural mais rapidamente que as aldohexoses. Em conseqüência, nas referidas condições e sendo curto o tempo de incubação, o resorcinol forma um produto colorido apenas com as cetohexoses. No entanto, prolongando-se o tempo de incubação, as aldoses reagem de maneira semelhante.
TÉCNICA
	
	Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Seliwanoff (HCl com resorcinol).
	Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solução de frutose
	Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solução de glicose
	Ao tubo 3 adicionar 1 ml de solução de sacarose
	Ao tubo 4 adicionar 1 ml de água destilada (tubo controle)
	Colocar todos os tubos ao mesmo tempo no banho-maria fervente e cronometrar o aparecimento de coloração vermelha. Anotar os resultados na seguinte tabela:
	
	1 min
	2 min
	4 min
	6 min
	
	
	
	
	
	Frutose
	
	
	
	
	Glicose
	
	
	
	
	Sacarose
	
	
	
	
	Água
	
	
	
	
 
	Qual é o melhor tempo para diferenciar entre a frutose e a glicose ? Quem dos dois monossacarídeos é a cetose ? Por que a sacarose reage?
4. TESTE DE BENEDICT
		Reação para identificar carboidratos redutores.
	Os monossacarídeos e alguns dissacarídeos possuem em suas estruturas grupos aldeído ou cetona, livres ou hidratados. Estes poderão reduzir certos íons metálicos contidos em reagentes especiais. A maioria destes reagentes contém sais de cobre e são usados para pesquisa de açúcares redutores. Um destes reagentes é o de BENEDICT que contém sulfato cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio. Este último composto produz um complexo azul com cobre divalente e isto evita a formação de hidróxido cúprico insolúvel no meio alcalino:
Cuprocitrato (Cu2+)
	Sob ação de um agente redutor, o cobre divalente é reduzido a cobre monovalente que não pode formar um complexo solúvel com o citrato. Conseqüentemente, o cobre precipita sob a forma de hidróxido cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidróxido cuproso passa a óxido cuproso de cor vermelha:
	
	redutor
	
	calor
	
	Cuprocitrato (Cu2+)
	(
	hidróxido cuproso (Cu+)
	(
	óxido cuproso(Cu+)
	solúvel, azul
	
	insolúvel, amarelo
	
	insolúvel, vermelho
�
TÉCNICA
	Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Benedict.
	Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solução de glicose
	Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solução de frutose
	Ao tubo 3 adicionar 1 ml de solução de sacarose
	Ao tubo 4 adicionar 1 ml de água destilada (tubo controle)
	Colocar todos os tubos no banho-maria fervente por 3 min. Retirar os tubos e anotar os resultados em forma de tabela. O que concluiu ?
5. TESTE DE IODO
		Identificação de polissacarídeos.
	Alguns polissacarídeos reagem com iodo formando produtos coloridos. Com o amido, a cor é azul, com o glicogênio é castanho-avermelhado. Os monossacarídeos não reagem. No amido, é a fração não ramificada (amilose) que é responsável pela formação do complexo da cor azul; a amilopectina reage de forma semelhante ao glicogênio.
TÉCNICA
	Marcar 3 tubos e distribuir neles:
	Tubo 1 - 2 ml de amido 1 %
	Tubo 2 - 2 ml de glicose 1 %
	Tubo 3 - 2 ml de água destilada (tubo controle)
	Aos 3 tubos adicionar duas gotas da solução de Lugol. Este reativo é uma solução de poli-iodetos, produzidos por dissolução de iodo metálico numa solução de iodeto de potássio, e ele reage como se fosse iodo elementar. Anotar os resultados em forma de tabela.
REVERSÃO DA REAÇÃO DO IODO PELO CALOR
	Colocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria fervente por alguns minutos até o desaparecimento da cor azul. Resfriar em água corrente. O que observou ?
	A cadeia da amilose (fração não ramificada do amido) tem a conformação de uma hélice que absorve o iodo no interior da espiral. Este complexo forma-se por interações fracas que podem ser desfeitas pelo calor.
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HIDRÓLISE DO AMIDO
	O amido quando tratado por um ácido a quente, sofre uma hidrólise sucessiva, dando várias dextrinas e como produtos finais, maltose e glicose.
	As dextrinas têm tamanhos diferentes, mas conservam, em princípio, a estrutura em hélice do amido. Em consequência, as dextrinas absorvem o iodo e sua reação com o reativo de Lugol gera soluções coloridas; as diferenças de coloração permitem classificar as diferentes dextrinas. (O reativo de Lugol é uma solução de poli-iodetos, produzidos por dissolução de iodo metálico numa solução de iodeto de potássio, e ele reage como se fosse iodo elementar). As cores observadas são as seguintes:
	AMIDO				cor azul
	AMILODEXTRINA		cor roxa
	ERITRODEXTRINA		cor alaranjada
	ACRIDEXTRINA		não dá cor
	A maltose e glicose possuem propriedades redutoras que podem ser reconhecidas pela reação de BENEDICT. O reativo de BENEDICT contém sulfato cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio. O último composto produz um complexo azul com cobre divalente, que evita a formação de hidróxido cúprico insolúvel no meio alcalino. A ação de um agente redutor (maltose e glicose) reduz o cobre divalente a cobre monovalente, o qual não pode formar um complexo solúvel com citrato. Consequentemente, o cobre precipita sob forma de hidróxido cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidróxido cuproso passa a óxido cuproso de cor vermelha:
	
	redutor
	
	calor
	
	Cuprocitrato(Cu2+)
	(
	hidróxido cuproso (Cu+)
	(
	óxido cuproso(Cu+)
	solúvel, azul
	
	insolúvel, amarelo
	
	insolúvel, vermelho
TÉCNICA
	Preparar um banho de água fervente e numerar 7 tubos de ensaio.
Num Erlenmeyer, colocar 30 ml da solução de amido a 15 % e 7 ml de HCl 2N.
Transferier 3 ml desta mistura para cada um dos tubos.
	Ao tubo 1 adicionar 1 gota do reativo de Lugol e observar a cor azul que se desenvolve.
Colocar os tubos restantes no banho de água fervente. Cada tubo será retirado ao término dos períodos de tempo indicados no quadro abaixo e, depois de resfriado em água corrente, receberá uma gota de Lugol, com exceção do tubo 7.
	Ao tubo 7 adicionar 3 ml do reativo de Benedict e retornar ao banho de água fervente. O aparecimento de um precipitado vermelho ou alaranjado indica a presença de substância redutora, no caso maltose ou glicose.
	TUBO
	MINUTOS DE
REAÇÃO
	COR
COM IODO
	PRODUTOS
IDENTIFICADOS
	
	
	
	
	1
	0
	
	
	2
	2
	
	
	3
	5
	
	
	4
	10
	
	
	5
	15
	
	
	6
	20
	
	
	7
	25
	Reação de Benedict
	
�
LIPÍDIOS
1. SAPONIFICAÇÃO
	Colocar num tubo de ensaio grande (25 x 200 mm) cerca de 0,5 g de gordura animal e adicionar 10 ml de solução alcoólica de KOH 0,5 N (extremamente corrosiva, não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml).
	Adaptar ao tubo de ensaio um tubo condensador cheio de água de torneira, que irá minimizar a evaporação do álcool. Colocar o conjunto (tubo grande + tubo condensador) em banho maria fervente e deixar lá por 5 minutos. Retirar o tubo do banho e remover o tubo condensador. Desprezar qualquer sobra eventual de material sólido e continuar apenas com o líquido contido no tubo grande.
	Adicionar 10 ml de água destilada à mistura de saponificação. Agitar. Observar a formação de espumas. Guardar o conteúdo do tubo para as experiências seguintes.
2. PREPARAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES
	Adicionar à mistura de saponificação, já diluída com água destilada, 1 ml de ácido clorídrico concentrado, gota a gota, agitando o tubo posteriormente com cuidado (o ácido é corrosivo, portanto não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Colocar novamente o tubo no banho maria até obter uma boa separação de camada oleosa, acima da camada aquosa (os ácidos graxos livres são pouco solúveis na água e menos densos que ela).
Deixar o tubo esfriar num recipiente com água gelada. A camada superior solidificará, pois os ácidos graxos de gordura animal são em grande parte saturados, tendo alto ponto de fusão, ao contrário dos ácidos graxos insaturados que predominam na gordura vegetal.
	Decantar o líquido do tubo e guardar apenas a parte sólida para as experiências seguintes.
3. SOLUBILIDADE DOS ÁCIDOS GRAXOS LIVRES
	Retirar com auxílio de um bastão de vidro, uma pequena quantidade dos ácidos graxos isolados e colocar num tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 2 ml de éter. Agitar. O que observou?
4. FORMAÇÃO DE SABÕES SOLÚVEIS POR REDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS LIVRES. 
	Adicionar ao tubo da experiência 2, que contém a maior parte dos ácidos graxos isolados, 10 ml de água destilada e 5 ml de solução alcoólica de KOH 0,5 N (extremamente corrosiva, não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Levar ao banho maria por 3 minutos. Agitar. Observar a formação de espumas. Conservar o conteúdo do tubo para a experiência seguinte.
5. FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS
	Tomar 2 tubos de ensaio e pipetar em cada um 2 ml da solução de sabões solúveis obtida na experiência anterior. Ao primeiro adicionar 10 gotas de solução de cloreto de cálcio 5% e ao segundo 10 gotas de solução de acetato de chumbo 10 %. Observar a formação de precipitados (sabões insolúveis de cálcio e chumbo, além dos respectivos hidróxidos).
6. REAÇÃO DO COLESTEROL COM O REATIVO DE LIEBERMAN-BURCHARD
	Colocar 1 ml de uma solução diluída de colesterol em um tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 10 gotas de anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado (os dois reativos são extremamente corrosivos, não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Observar após alguns minutos o aparecimento de uma coloração esverdeada. Esta reação, de mecanismo oxidativo, identifica os esteróides que possuem dupla ligação entre os carbonos 5 e 6 (anéis A e B), como o colesterol.
	 COLESTEROL					 CÁTION CARBÔNICO 
								 PENTAENÍLICO
�
IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
	Os ácidos nucléicos presentes num tecido (especialmente o DNA) podem estar firmemente ligados a cátions ou a proteínas catiônicas, tais como histonas e protaminas. Assim, estas proteínas estarão presentes juntamente com os ácidos nucleicos, quando estes últimos forem precipitados a partir de um homogenato de fígado de rato. Os polinucleotídeos podem ser precipitados pela ação de soluções salinas, ou por álcool em presença de sais. Nesta prática, usamos um método mais antigo que utiliza o ácido tricloroacético para precipitar complexos nucleoprotéicos. O precipitado nucleoprotéico é posteriormente dissociado a quente, libertando-se os ácidos nucléicos sob forma de oligonucleotídeos solúveis, enquanto que as proteínas permanecem insolúveis. Em seguida, no extrato solúvel dos oligonucelotídeos será testada a presença dos açúcares característicos do RNA e DNA.
	 A reação do orcinol (reativo de Bial) permite identificar o RNA, através da ribose presente. Determinações quantitativas foram procedidas usando esta reação (conforme Schneider & Hoogebom e Dische & Schwartz, 1937).
	
	+ HCl
	
	+ orcinol
	
	Ribose
	(
	Furfural
	(
	Derivado Trifenilmetano
	No passado, a reação da difenilamina com desoxirribose foi muito utilizada para identificar e determinar quantitativamente o DNA (reação descrita por Dische em 1930, e mais usada na sua versão modificada por Burton em 1956). O DNA em meio ácido é hidrolizado libertando desoxirribose, e esta, através do seu grupamento CHO livre, reage com a difenilamina com formação de composto de cor azul, com absorção a 600 nm.
TÉCNICA
	1. Obtenção de homogenato de fígado de rato.
	2. Extração de ácidos nucleicos do homogenato.
	3. Identificação de DNA no extrato ácido pela reação da difenilamina.
	4. Identificação de RNA no extrato ácido pela reação do orcinol.
PROCEDIMENTO
	1. 	Obtenção de extrato ácido de ácidos nucléicos.
1.1. Homogenizar o fígado de um rato em nove volumes de sol. ácido cítrico 2%. Pipetar 2 ml do homogenato num tubo de centrífuga e adicionar 1 ml de sol. ácido tricloroacético 20 %. Agitar. Deixar em repouso por 10 minutos.
	1.2. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante.
1.3. Ao sedimento (ácidos nucleicos e proteínas), juntar 5 ml de sol. ácido tricloroacético 5%. Misturar cuidadosamente com bastão de vidro e decantar a suspensão para um tubo de ensaio (o tubo de centrífuga não pode ser esquentado).
1.4. Levar ao banho maria fervente por 20 minutos. Esfriar e transferir novamente a supensão para o tubo de centrífuga. 
1.5. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Decantar o sobrenadante para um tubo de 	ensaio limpo (o sobrenadante conterá quase todo RNA e DNA existente nos 2 ml de 	homogenato usados inicialmente).
	2. Identificação dos ácidos nucleicos no extrato ácido. 
2.1. Identificação do DNA. Pipetar num tubo de ensaio 2 ml do sobrenadante da etapa 1.5 e em outro tubo, 2 ml de água destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 2 ml do reativo da difenilamina (corrosivo, não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Agitar. 	Aquecer os dois tubos a 100o C por 10 minutos. O que observou? 
2.2. Identificação do RNA. Pipetar num tubo de ensaio 0,2 ml do sobrenadante da etapa 1.5 e em outro tubo, 0,2 ml de água destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 0,8 ml de água destilada e 2 ml do reativo de orcinol (corrosivo, não aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Agitar. Levar ao banho maria fervente por 10 minutos. O queobservou? 
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INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO E SOLUÇÕES