APOSTILA PRÁTICAS INTRODUÇÃO

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PRÁTICAS
INTRODUÇÃO AO
 ESTUDO DOS
 ANTIBIÓTICOS
2015
 ISOLAMENTO DE ACTINOBACTÉRIAS
 INTRODUÇÃO
 Embora o seu aspecto macroscópico se assemelhe ao dos fungos filamentosos, as actinobactérias estão incluídas entre as bactérias devido às suas dimensões (hifas com 1(m de diâmetro), composição química e atividades bioquímicas.
 As colônias de actinobactérias podem ser facilmente distinguidas das de outras bactérias e fungos pelas seguintes características:
 Colônias compactas
 Cobertas por uma película fina (coriácea)
 Superfície seca que oferece resistência
 Geralmente recobertas por micélio aéreo
 Habitats: Solo, água ( de rios, de lagos e do mar ) cereais, tecido vegetais e animais.
 
 As actinobactérias ocupam um lugar de destaque entre os micro-organismos produtores de antibióticos e, entre as actinobactérias produtoras de antibióticos, o gênero Streptomyces é o mais importante.
 Streptomyces é um grupo de micro-organismos unicelulares, ramificados, que se reproduzem tanto por fragmentação das hifas, como por meio de esporos ou de conídios.
 Objetivos:
 Identificar macroscopicamente actinobacterias, bactérias e fungos do solo. Obter culturas puras.
 Materiais: 
 Solo de qualquer procedência, placas de Petri, tubos de ensaio, água estéril, pipetas, meios de cultura (ISP2, Czapek, BDA, GAA), alça de platina.
 ISP-2 Czapek
 Extrato de levedura 4g NaNO3 2g
 Extrato de malte 10g K2PO4 1g 
 Dextrose 4g MgSO4 0,5g 
 Água destilada 1000ml FeSO4 0,01g
 Agar 15g Sacarose 30g
 pH = 7,2 Água destilada 1000ml
 Agar 15g
 BDA GAA
 Extrato de batata 1000ml Glicerol 10g
 Glicose ou Dextrose 20g Asparagina 1g
 Agar 15g K2PO4 1g
 pH = 6,8-7,0 Agar 15g
 pH = 7,0
 Pode-se fazer pré-tratamento das amostras de solo, com a finalidade de proporcionar melhores rendimentos, reduzindo o número de bactérias e fungos. 
 Formas de Pré-tratamento:
 1. Amostra seca ao ar.
 Misturar CO3Ca com o solo seco e incubar a 28oC durante 5 a 6 dias. 
 Vantagem: Reduz o número de células bacterianas vegetativas, permitindo a sobrevivência de muitas espécies de actinobacterias.
 2. Incubar o solo a 50oC durante 10 minutos.
 Vantagem: Elimina bactéria e fungos.
 Desvantagem: Elimina também actinobacterias termo-sensíveis.
 3. Usar antifúngicos.
 Vantagem: Elimina fungos
 4. Usar antibacteriano.
 Vantagem: Elimina bactérias
 Desvantagem: Pode reduzir o número de actinobacterias.
 Protocolo
 1. Colocar 1g da amostra do solo em tubo de ensaio contendo 9ml de água estéril, homogeneizando o conjunto. 
 2. Retirar 1ml da suspensão homogeneizada e fazer diluições sucessivas de 1/10 até a 10-5 diluições.
 3. Usar as diluições 10-4 e 10-5 nas quantidades 0.1ml em placas de Petri estéreis, adicionando na superfície dos meios gelosados apropriados (ISP-2, Cz, BDA, GAA ) 12ml.
 4. Incubar as placas por 5 a 7 dias em estufa a 30oC. Após o período de incubação, as colônias de actinobactérias isoladas serão transplantadas para tubos de ensaio contendo o meio nutritivo de origem, inclinado, os quais serão incubados em estufa de 30oC por um período de 5 a 7 dias. 
BLOCO DE GELOSE
O teste de Bloco de gelose (teste qualitativo) é um método de difusão em que várias culturas são analisadas frente a um único micro-organismo-teste.
OBJETIVOS: Selecionar culturas antibioticamente ativas frente a micro-organismos teste.
MATERIAIS: Culturas puras de actinobactérias, culturas recentes de micro-organismos teste, placas de Petri, tubos de ensaio, água estéril, pipetas e meios de cultura (ISP-2, GL).
MICRORGANISMOS-TESTE:
1 Staphylococcus aureus Gram +
16 Bacillus subtilis Gram +
224 Escherichia coli Gram -
71 Mycobacterium smegmatis AAR (álcool-ácido resistente)
138 Enterococcus faecalis Gram +
1007 Candida albicans Levedura
PROTOCOLO
1ª etapa
1. Colocar em placa de Petri estéril, esporos ou fragmentos da cultura em estudo.
2. Suspender os esporos ou macerar os fragmentos em 0.5 ml de água esterilizada. 
3. Adicionar 12 ml de ISP-2 devidamente esfriado (45ºC), homogeneizando o conjunto.
4. Incubar as placas por 5 a 7 dias.
2ª etapa
1. Fazer semeadura dos microorganismos-teste em placa de Petri contendo o meio de cultura GL.
2. Cortar com furador apropriado blocos dos Streptomyces da 1ª etapa em número correspondente aos 7 micro-organismos teste.
3. Colocar os blocos de gelose sobre o semeio, assepticamente, com o auxílio de estilete ou alça de platina.
4. Incubar, de acordo com a exigência do micro-organismos teste, a 30ºC ou 37ºC.
3ª etapa
Leitura dos resultados
Após 24 a 48 horas de incubação, proceder à leitura dos resultados. 
A atividade é avaliada pela inibição do crescimento do micro-organismo indicada por um halo em torno do bloco da actinobactéria, cujo diâmetro se mede em milímetros. Quanto maior o halo de inibição formado em volta do bloco, maior a atividade.
TESTE DE DISCO DO MOSTO FERMENTADO
 
 Através deste teste pode-se evidenciar quais as culturas que produzem substâncias antibióticas e quais os meios adequados para a sua produção.
 É um método de difusão como o Bloco de Gelose, em que várias culturas em estudo são comparadas frente a um único micro-organismo teste. 
OBJETIVOS :
 Selecionar culturas antibioticamente ativas, determinando tempo e o meio adequado de produção. 
MATERIAIS:
Culturas puras de actinobactérias, placas de Petri, tubos de ensaio, água estéril, pipetas, meios de cultura (MPE- AVP), discos de papel, pinça.
MICRORGANISMOS-TESTE:
Staphylococcus aureus (1) Gram +
Bacillus subtilis (16) Gram +
Escherichia coli (224) Gram -
Mycobacterium smegmatis (71) AAR
Enterococcus faecalis (138) Gram +
Candida albicans (1007) levedura
Os meios de cultura mais utilizados para cultivos submersos são o M-1, MPE e o K, porém, o MPE geralmente é o de melhor produção.
 Inoculando-se uma cultura pura em meios para cultivos submersos, 4 fases são observadas durante o processo:
Lag fase
Exponencial ou logarítmica
Estacionária
Dedeclínio
Lag fase: É a fase de adaptação da cultura ao meio. Não há apreciável crescimento do número de células. Fase exponencial ou logaritmica: É a fase de crescimento. Verifica-se quando a cultura atinge taxa constate de crescimento. Fase estacionária: Perdura enquanto as condições do meio permitirem, podendo durar horas, ou mesmo dias, antes que o número de mortes celulares comece a ultrapassar o de crescimento. Fase de declínio: Nesta fase o número de células que morrem torna-se progressivamente superior ao das que surgem. Nunca morrem todas as células, pois algumas vivem muitas vezes às custas das células mortas.
PROTOCOLO
As culturas previamente inoculadas no meio MPE (para cultivos submersos) serão testadas em disco de papel após 24, 48, 72 e 96 horas de cultivo sob agitação de 200 r. p. m. à temperatura ambiente.
1. Preparar as suspensões dos micro-organismos teste, em água destilada esterilizada ou solução fisiológica.
2. Fundir o meio GL, resfriá-lo à temperatura de aproximadamente 48 oC, distribuir 10 a 12 mL em placas de Petri e deixar solidificar.
 3. Semear o microrganismo-teste sobre a superfície do meio, com auxílio de um “swab” esterilizado.
4.Com o auxílio de uma pinça, em condições assépticas, embeber um disco de papel esterilizado, no mosto fermentado.
5. Depositar o disco embebido na superfície do meio semeado.
4. Incubar as placas a 30 oC ou 37 oC, conforme as exigências do micro-organismo teste.
5. Após 24 ou 48 horas de incubação, proceder à leitura dos resultados, medindo o diâmetro do halo de inibição (em mm) formado em torno dos discos.
PROVA DE UNIDADE ( WAKSMAN )
A prova de unidade indica quantitativamente a atividade antimicrobiana do líquido fermentado em unidade arbitrada por Waksman, considerando-a igual a uma unidade por mililitro (1 U/mL) quando 1mL do líquido fermentado inibe o crescimento do germe teste.
 Baseada nos resultados obtidos no TESTE DE DISCO DO MOSTO FERMENTADO, esta prova é realizada no tempo correspondente à melhor fermentação, com o meio que tenha apresentado maiores halos e com os micro-organismos que a actinobactéria demonstrou ter atividade.
 
 
OBJETIVO: Quantificar em U/mL a atividade do líquido metabólico 
 
MATERIAIS: Líquido metabólico filtrado, placas de Petri, tubos de ensaio, meio de cultura (GL), micro-organismos teste e alça de platina em L.
PROTOCOLO:
Filtrar o mosto fermentado.
Colocar diferentes alíquotas ( 0,01; 0,02; 0,03; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1 ml ) do líquido metabólico (LM) em placas de Petri e completar para 10 ml com o meio de cultura adequado, homogeneizando o conjunto.
Semear o micro-organismo teste em estrias, com alça de platina em L, tendo-se o cuidado de fazer a placa controle.
Incubar as placas a 30 ou 37 oC e fazer as leituras com 24 ou 48 horas, conforme o microrganismo teste. 
 Para se obter a quantidade de atividade contida no LM algumas vezes é necessário fazer diluições do mesmo conforme o quadro abaixo. A atividade antimicrobiana é inversamente proporcional à quantidade do líquido fermentado utilizado para inibir o germe.
	 
Volume do LM
(mL)
	 Atividade em U/ml
	
	 Sem diluição 
	Com diluição
	
	
	 1:2
	 1:3 
	 1:5
	 1:10
	 1
	 10
	 20
	 30
	 50
	 100
	 0,5
	 20
	 40
	 60
	 100 
	 200
	 0,3
	 30
	 60
	 90
	 150
	 300
	 0,2
	 50
	 100 
	 150
	 250
	 500
	 0,1
	 100
	 200
	 300
	 500
	 1000
	 0,05
	 200
	 400
	 600
	 1000
	 2000
	 0,03
	 300
	 600
	 900
	 1500
	 3000
	 0,02
	 500
	 1000 
	 1500
	 2500
	 5000
	 0,01
	 1000
	 2000
	 3000
	 5000
	 10000 
 Leitura:
Observa-se a última placa onde houve inibição do microrganismo e a primeira onde houve crescimento.
	O resultado é dado pela seguinte fórmula:
 AL = VT ( VA
ONDE: AL = Atividade do líquido metabólico
 VT = Volume total da placa
 VA = Volume da alíquota do líquido metabólico
 
 Exemplo: Um líquido metabólico inibiu o crescimento do micro-organismo teste nas placas contendo 1 ml; 0,5; 0,3; 0,1; 0,05, e houve crescimento nas placas de 0,03; 0,02; 0,01.
 Divide-se o volume total da placa pelo volume do líquido metabólico, ou seja, 10 : 0,05 = 200
 10 : 0,03 = 300
 A atividade do líquido metabólico esta entre 200-300 U/ml 
 
EXTRAÇÃO DO ANTIBIÓTICO CONTIDO NO LÍQUIDO FERMENTADO E /OU MICÉLIO
 Conhecido o meio apropriado e a curva de fermentação da cultura, procede-se a tentativa de extração. O antibiótico pode estar contido na massa celular no líquido metabólico ou em ambos.
 A maioria dos Streptomyces tem o seu ponto ótimo de fermentação às 72 horas a 200rpm e à temperatura de 28 a 30oC.
 Na extração do antibiótico seguem-se as etapas abaixo:
1. Separar o líquido do micélio por centrifugação ou filtração.
2. Trabalhar com o micélio como se segue:
 a) Dividir o micélio em nove partes iguais; colocar em frascos contendo os solventes etanol, metanol, acetona, nos pH 2,0; 7,0; 9,0.
 b) Agitar.
 c) Filtrar.
 d) Ajustar todos para pH 7,0
 e) Testar (teste de disco)
3. Trabalhar com o líquido como se segue:
 a) Separar o líquido em partes iguais de acordo com a quantidade de solventes utilizados, não esquecendo o controle.
 b) Utilizar os solventes: acetato de etila, clorofórmio, eter etílico, butanol, eter de petróleo, benzeno, hexano, nos pH 2,0; 7,0; 9,0.
 c) Colocar o líquido e o solvente em frascos, na proporção de 1:1 (v/v).
 d) Agitar.
 e) Retirar o extrato (que estará separado do líquido metabólico).
 f) Ajustar todos para pH 7,0. 
 g) Testar (teste de disco)
Obs.: Caso nenhum solvente consiga extrair o antibiótico contido no líquido, fazer adsorsão com carvão ou resina de troca iônica e em seguida eluição com etanol, metanol e acetona. 
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
CIM
 A concentração inibitória mínima é definida como a menor quantidade de antibiótico capaz de inibir o crescimento de um micro-organismo.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA EM MEIO LÍQUIDO
 A determinação da CIM é feita, inoculando-se uma série de tubos contendo um determinado volume de Caldo Mueller Hinton e diferentes concentrações do antibiótico a ser testado, com um volume conhecido da suspensão do micro-organismo teste. Considera-se a CIM (concentração bacteriostática), a concentração do antibiótico do primeiro tubo onde não ocorreu crescimento visível (turvação do meio) após 24 horas de incubação.
Meios utilizados:
 Caldo Mueller Hinton
 Agar Mueller Hinton
Preparação da solução do antibiótico
 1. Pesar 12,8mg do antibiótico a ser testado.
 2. Fazer uma solução a 1280 (g/mL( solução mãe ):
 12,8mg = 12800 (g 
 1280 (g _________1mL
 12800 (g _____ X mL X = 10mL ( DMSO, H2O ).
 3. Utilizar concentrações de 128 a 0,125 (g/mL preparadas no momento de uso em caldo Mueller Hinton a partir da solução mãe.
Preparação do inóculo
 1. Inocular as culturas teste em caldo Mueller Hinton com 5 ou mais colônias obtidas a partir de um semeio em placa. 
 2. Incubar durante 18 horas a 37oC sob agitação.
 3. Padronizar o inóculo para umaconcentração final de 107 / 108 UFC/mL.
 
Determinação da concentração 
 
 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0, 125 
(µg/mL)
1. Inocular nos tubos controle (sem antibiótico) e nos tratados (concentração de 128 (g/ml a 0,125 (g/ml ) 0,01 mL da suspensão do micro-organismo teste a 107 / 108 UFC/mL. 
2. Incubar os tubos sob agitação por 18 horas à 37oC.
3. Fazer a leitura observando a ausência de turvação. O primeiro tubo onde ocorre ausência de crescimento indica a dose bacteriostática do antibiótico ou a CMI.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA BACTERICIDA
CMB
1. Distribuir 18 mL do meio Mueller Hinton em placa de Petri.
2. Semear imediatamente após a determinação da CIM 10(L de cada tubo com crescimento visível ou não na placa de Petri contendo o meio Mueller Hinton.
3. Incubar a 37oC durante 18 horas.
4. Contar o número de células viáveis.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA EM MEIO SÓLIDO
Meios utilizados:
 Caldo Mueller Hinton
 Agar Mueller Hinton
Preparação da solução do antibiótico
 1. Pesar o antibiótico a ser testado em quantidade suficiente para uma solução a uma concentração determinada (Ex: 2000(g/mL) 
 Ex: Peso = 7,5 mg (= 7.500(g)
 2000(g 1 mL
 7.500(g _______ X mL
 X = (7.500(g X 1 mL) (2000(g = 3,75 mL ( DMSO, H2O ).
 2. Utilizar alíquotas de volumes variados (1 mL a 0,01).
Preparação do inóculo
 1. Inocular as culturas teste em caldo Mueller Hinton com 5 ou mais colônias obtidas a partir de um semeio em placa. 
 2. Incubar durante 18 horas a 37oC sob agitação.
 3. Padronizar o inóculo para uma concentração final de 107 / 108 UFC/mL.
Determinação da Concentração
Inocular nas placas as alíquotas da solução do antibiótico.
Colocar 10mL do meio de cultura nas placas homogeneizando o conjunto. 
Semear o micro-organismo teste em forma de estria com a alça de platina em L.
Incubar as placas a 35/37oC por 24 horas.
 Fazer a leitura observando a ultima placa onde houve inibição do microrganismo (CMI) e a primeira onde houve crescimento. 
Alíquotas da solução do antibiótico:
 1mL 0,5mL 0,25mL 0,12mL 0,06ml 0, 03mL 0,01mL 
 Controle (sem antibiótico)
 
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM VEGETAIS SUPERIORES
 
Primeira parte
 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
PROTOCOLO:
1. Etiquetar frascos Erlenmeyer (três para cada parte da planta), indicando a parte da planta e o solvente utilizado.
2. Cortar as partes da planta que serão analisadas (raiz, caule, folha, flor, frutos, sementes, etc.).
3. Colocar o equivalente a aproximadamente 8 gramas do material cortado nos frascos e cobrir com o solventes extrator: etanol, metanol e acetona.
4. Tamponar os Erlenmeyer 
5. Deixar em repouso por 48 horas, ao abrigo da luz.
Segunda parte
TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS BRUTOS DE DIFERENTES PARTES DA PLANTA
MÉTODO UTILIZADO: Difusão em disco de papel (Bauer et al, 1966)
PROTOCOLO:
Fundir o meio: AN (para bactérias)
 SAB (para leveduras e fungos filamentosos)
2. Resfriar o meio (aproximadamente 48 – 50 oC ) e distribuir 10 ml em placas de Petri
3. Preparar as suspensões dos micro-organismos teste:
 		Staphylococcus aureus (01) - Bactéria Gram-positiva
 Escherichia coli (224) 	 - Bactéria Gram-negativa
 Candida albicans (1007)	 - Levedura
4. Numerar os extratos, anotando no caderno a qual extrato corresponde a numeração.
5. Marcar o fundo da placa com a numeração dos extratos.
6. Após solidificação, semear o meio com a suspensão microbiana, com auxílio de “swab”. 
7. Embeber o disco de papel no extrato da planta, tendo o cuidado de esgotar o excesso, na parede do frasco.
8. Colocar o disco embebido com o extrato na superfície do meio semeado, no local marcado com o número correspondente.
9. Incubar as placas a 30 oC (levedura) ou 37 oC (bactérias), durante 24 a 48 horas, conforme as exigências do micro-organismo teste (bactérias e leveduras geralmente crescem bem com 24 horas. Fungos filamentosos e algumas espécies de bactérias podem ter um crescimento mais lento e requerem um tempo maior de incubação).
6. Após o período de incubação, proceder à leitura dos resultados, medindo o diâmetro do halo de inibição formado ao redor do disco, em milímetros.
 
INTERPRETAÇÃO:
Quanto maior o diâmetro do halo, maior a atividade do extrato vegetal.
SINERGISMO ENTRE ANTIBIÓTICOS
INTRODUÇÃO
Existem casos em que a administração de uma associação de dois ou mais antibióticos, é aconselhável, a exemplo do que acontece no tratamento da ENCOCARDITE causada por Enterococcus sp. 
As combinações de antibióticos podem ser de dois tipos:
- SINÉRGICAS: Quando a atividade da associação é maior que o somatório das atividades dos antibióticos, individualmente.
 EX: Penicilina (ou ampicilina) + gentamicina para Enterococcus
 A atividade da associação é maior que a da penicilina isolada.
 EX: Sulfonamida + trimetoprim para Escherichia coli
ANTAGÔNICAS: Quando a presença de um antibiótico reduz a atividade de outro
 EX: Nitrofurantoína + ácido nalidíxico para Escherichia coli
A ação do ácido nalidíxico é antagonizada pela presença da nitrofurantoína.
Embora tanto o efeito sinérgico como o antagônico, entre dois antibióticos, possam ser demonstrados com relativa facilidade in vitro, sua comprovação in vivo é difícil.
MÉTODO 
 O método usado é o da difusão em disco de papel 
MATERIAL
Placas de Petri
Pipeta de 10 mL esterilizada
“Swabs”esterilizados
Tubos de ensaio esterilizados
Água destilada esterilizada
Meio de cultura - ägar nutritivo (AN)
Pinça 
Culturas recentes dos micro-organismos teste (bactérias sensíveis aos dois antibióticos)
Discos para antibiograma dos antibióticos a serem testados
PROTOCOLO
A partir de culturas recentes dos microrganismos-teste, preparar suspensões em água destilada esterilizada padronizada de acordo com a escala de Macfarland ( tubo 0,5).
Com auxílio de “swab” esterilizado, semear a suspensão microbiana sobre a superfície do meio. 
Com auxílio de uma pinça flambada, colocar os discos dos antibióticos sobre o semeio. 
Incubar a 37 oC durante 18 - 24 horas.
Observar os resultados, comparando os diâmetros dos halos.
RESISTÊNCIA INDUZIDA A CLINDAMICINA 
PROTOCOLO:
1. Semear Staphylococcus aureus em placa de Petri contendo o meio de cultura AN.
2. Colocar o disco de Clindamicina (2(g) a uma distância de 15 a 26 mm do disco de Eritromicina (15(g) sobre o semeio.
3. Incubar durante 18 a 24 horas.
Resultado:
Staphylococcus aureus que não apresentar achatamento do halo do disco de Clindamicina será considerado como sensível à Clindamicina.
Staphylococcus aureus que apresentar achatamento do halo do disco de Clindamicina, adjacente ao de Eritromicina será considerado como resistente à Clindamicina (Teste “D” positivo).
0,2 mL
1mL 
1mL 
1mL 
1mL 
1mL 
1mL 
SOLUÇÃO-MÃE:
1280 µg/mL
1,8ml 
MH
1mL
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
lml 
MH
1mL 
1mL1mL 
1mL 
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mLMH
10mL
MH
10mLMH