Microscopias: Componentes e Princípios

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Microscopias
	Objetivos
	
● Conceituar microscópio óptico (MO)
● Citar os componentes da parte mecânica do MO e suas funções.
● Citar os componentes da parte óptica do MO e suas funções.
● Identificar e dizer o significado de cada inscrição do corpo metálico das objetivas e das oculares.
● Definir limite de resolução e poder de resolução do MO.
● Definir abertura numérica. 
● Conceituar distância de trabalho (WD).
● Descrever o princípio básico da microscopia de Fluorescência.
● Descrever o princípio básico da microscopia Confocal a laser.
● Citar outros tipos de microscopia de luz.
● Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de transmissão e sua importância para o estudo ultraestrutural das organelas celulares.
● Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de varredura.
● Citar a importância da microscopia eletrônica (tomografia).
Principais diferenças entre o MO e o MET
 
	
	Microscópio Óptico
	A invenção do microscópio óptico (MO) causou uma verdadeira revolução no pensamento humano, colo-cando ao alcance do homem um universo até então desconhecido e inacessível. Hoje em dia, o MO tornou-se indispensável em praticamente todas as atividades científicas e industriais; nos laboratórios em geral, na medicina, na pesquisa, nos setores de controle de qualidade de produção e nas empresas. 
Definição
O MO trata-se de um instrumento de óptica com capacidade de mostrar bastante ampliada (aumento) e com determinados detalhes (resolução), a imagem de pequenas estruturas não visíveis ao olho desarma-do.
De acordo com as referências bibliográficas consultadas, verificamos que, para fins didáticos, o microscó-pio óptico pode ser dividido em várias partes; adaptamos àquela proposta por José Hibb (2003). Assim, podemos distinguir duas partes: 
Mecânica ou Estativa - serve de suporte para a parte óptica e para o manuseio da preparação histológica em estudo;
Óptica - destinada a obtenção e ampliação da imagem do corte, bem como, fornecer iluminação adequada ao mesmo.
Mecânica ou Estativa
Base
Normalmente trata-se de uma peça quadrada ou ligeiramente retangular, com 5cm de altura, que tem por funções: sustentar os demais componentes da parte mecânica do Microscópio e; abrigar, internamente, alguns componentes do sistema óptico de iluminação (lâmpada, lentes convergentes e espelho). Na sua parte antero-superior, possui um diafragma de campo e uma lente convergente.
Coluna
Encontra-se presa na extremidade posterior da Base, com formato de um "L" invertido, sendo a parte me-nor, responsável pela sustentação do Corpo binocular (antigo Tubo) e do Revolver e, na parte maior, a Pla-tina, a Subplatina e os  Mecanismos de Movimentos.
Corpo Binocular
É uma peça metálica, com formato de trapézio, que tem como funções principais: 
1. Proteger internamente, um sistema de prismas que desvia os raios luminosos lentes( lentes da objetiva ( corte (provenientes do sistema de iluminação oculares e daí à retina de nossos olhos;
2. Sustentar em sua parte superior externa, as oculares.
Revolver
É uma peça metálica, cromada, de forma circular-achatada, presa centralmente à parte inferior da Coluna (braço menor), por meio de um parafuso. Possui 4 ou 5 orifícios que servem para sustentar as Objetivas e apresenta um movimento giratório, através do qual permite a inserção de cada uma delas no eixo óptico (linha vermelha)
Platina
É uma peça plana, geralmente quadrada e fixa (não giratória), que serve para suporte da preparação histológica em estudo. Fica presa à Coluna e disposta perpendicularmente ao eixo óptico da Objetiva. No centro, apresenta um orifício que permite a passagem dos raios luminosos provenientes do sistema de Iluminação, localizado abaixo da Subplatina. Na parte superior da Platina, encontramos o Charriot, sistema de presilhas (uma fixa e a outra móvel)  apropriado para prender e movimentar a preparação histológica, no sentido norte-sul e leste-oeste, através de seus parafusos (parafusos do Charriot).
Mecanismos de Movimentos
Consiste de um sistema formado por dois parafusos grandes e coaxiais, de avanço amplo e rápido, o Ma-crométrico, e de outro sistema também composto por dois parafusos pequenos e coaxiais, de avanço lento e diminuto, o Micrométrico. O primeiro movimenta a platina proporcionando a aproximação entre a Obje-tiva e a preparação histológica (foco do corte), ao passo que, o segundo, também movimenta imperceptivelmente aos olhos desarmados, a altura da Platina e assim possibilita à obtenção do foco fino da preparação.
Formação e Ampliação da Imagem 
Objetiva
São formadas por um sistema de lentes convergentes, montadas em um tubo metálico. Formam uma ima-gem Aumentada, Real e Invertida, do objeto em estudo. A objetiva tem Poder de Resolução, ou seja, a ca-pacidade de produzir imagens nítidas ou distintas de pontos situados muito próximos entre sí.
Geralmente, as objetivas são classificadas de acordo com o grau de correção das aberrações.  A objetiva de uso geral para trabalhos de rotina é a acromática, enquanto que, para fotomicrografias, a mais aperfeiçoada é a plan-apocromática. 
Aberrações
Denominam-se aberrações, aqueles defeitos de imagens produzidos normalmente nas lentes, devido a fenômenos de dispersão à deflexão da luz que passa pelas mesmas. Se as aberrações não forem corrigidas, as lentes tendem a produzir imagens distorcidas, pouco nítidas e em cores alteradas.
As principais aberrações produzidas pelas lentes são:
Cromática
É devido ao fato das lentes simples não poderem concentrar em um só ponto os raios de diferentes com-primentos de onda (de diferentes cores), de modo que formam imagens borradas, com anéis coloridos. Esta aberração é corrigida através do uso de objetivas acromáticas, apocromáticas que oferecem imagens claras, desprovidas destes halos (anéis).
Esférica
Uma lente simples tende a focalizar raios que passam na sua periferia, em local mais próximo (a) do que os raios que passam no seu centro (b). Em decorrência, produzirá uma imagem pouco nítida.
Curvatura de campo
A imagem ampliada, produzida por uma lente, tende a ser curva. Evidentemente, esta distorção da ima-gem prejudica a sua qualidade e impede que todo o campo seja visto em foco ao mesmo tempo. Nestas condições, o centro do campo aparece em foco e a periferia desfocada, ou vice-versa.
Todas estas aberrações são corrigidas nas lentes do microscópio, por diversas técnicas. A mais importante consiste em associar várias lentes de características diferentes que neutralizem as aberrações. Assim, as melhores objetivas são constituídas por um número maior de lentes e, consequentemente, têm seus preços mais elevados.
Significado das Inscrições no Corpo Metálico das Objetivas
Várias inscrições podem ser vistas no corpo metálico das objetivas. De acordo com o que será apresentado em sala de aula, observamos, em um lado, a marca da firma (Carl Zeiss - Germany), e do outro: na parte superior esquerda, o Tipo e o Poder de Aumento da Objetiva (Plan 25); na inferior esquerda, o comprimen-to do Tubo (ou corpo binocular) em mm (170); na parte superior direita, a Abertura Numérica (A 0,45) e na inferior direita, espessura máxima da lamínula em mm (0,17). Além destas, podemos encontrar ainda, os tipos: ( - ) - objetiva que pode ser usada com ou sem lamínula, e: (0) - objetiva que deve ser usada somente sem lamínula.
Poder de Resolução
Denomina-se Poder de Resolução a capacidade que tem os instrumentos ópticos de formarem imagens distintas de pontos situados próximos uns dos outros. No microscópio óptico, esta característica básica é inerente da Objetiva. O Poder de Resolução  depende  do comprimento  de onda (λ) e da Abertura Numérica ( AN ).
Limite de Resolução
Denomina-se Limite de Resolução a menor  distância que deve haver  entre dois pontos paraque eles pos-sam ser  definidos ou para que apareçam  individualizados. O Limite de Resolução é inversamente propor-cional ao Poder de Resolução. Limite de Resolução de uma  Objetiva ou  Microscópio  Óptico pode ser ex-presso pela fórmula :
LR = (K x  λ) / AN
Abertura Numérica (AN)
A Abertura Numérica expressa uma relação matemática entre o Poder de Resolução de uma Objetiva e sua capacidade de captar luz. Abertura Numérica é definida matematicamente, como o produto do menor índice de refração ( n ) interposto entre a preparação histológica e a objetiva pelo seno do semiângulo de abertura ( sen µ), sendo este, o ângulo formado pelos raios mais externos que penetram na Objetiva. As-sim, podemos dizer que:
 
AN  =  n x sen µ
  
Nas Objetivas a seco ( 4X, 10X e 40X ), existe AR entre a lente frontal da Objetiva e a preparação histológica ; o índice de refração ( n ) dado é de valor 1,00.  Na Objetiva de imersão em óleo ( 100X ), utilizamos uma gota de óleo entre a preparação histológica e a lente frontal da mesma e o índice de refração passa a ter um valor maior do que aquele estipulado para o AR : 1,51 .
Comprimento de Onda (λ)
Com relação ao comprimento de onda, os  melhores  e mais altos valores de resolução foram obtidos com o uso do ultravioleta, que possui o menor λ.  Na região  mais curto, seguido pelo  verde e(visível do espectro, a luz Azul tem o vermelho. Na prática, a preparação histológica é iluminada por luz branca, constituí-da por diversos comprimentos  de  onda. Geralmente, toma-se o λ da faixa do verde-amarelo (0,55mm) para o cálculo do  Limite de Resolução,  fixando-se o valor da constante ( K ) em 0,61. Para a sala de aula, não podemos alterar o λ e, assim, a Resolução fica restrita à AN das Objetivas; quanto mais complexas e corrigidas oticamente forem as Objetivas, maiores serão os valores de AN Com dois exemplos, mostraremos que o Limite de Resolução é estritamente dependente da AN da Objetiva e que não existe relação com o Aumento final dado pelo microscópio óptico (Poder de Aumento da Objetiva versus Poder de Aumento da Ocular) e nem com o Poder de Aumento da Ocular utilizada (levando em consideração  as  nossas condições de sala de aula prática):
Exemplo 1    A: (Obj. 10X) - (Oc. 20X) - (AN = 0,15) - (AF = 200X)
                       B: (Obj. 40X) - (Oc. 05X) - (AN = 0,65) - (AF = 200X)
Aplicando-se a fórmula,  verifica-se  que  no caso A, o Limite de Resolução será de 2,2 mm e, no caso B,  0,5  mm. Portanto,  mesmo sendo o Aumento Final (AF) de ambos os  microscópios  iguais  ( 200X ),  a  imagem fornecida  pelo  caso  B  será muito  mais rica  em detalhes.
Exemplo 2    A: (Obj.  40X) - (Oc. 10X) - (AN = 0,65) - (AF = 400X)
                       B: (Obj. 40Xi) - (Oc. 10X) - (AN = 1,00) - (AF = 400X)
Ao compararmos as duas situações, onde usamos a mesma Ocular, com Objetivas de 40X normal e 40Xi de imersão, o que variamos foi simplesmente a AN da segunda (1,00 ao invés de 0,65), sendo o Aumento Final o mesmo. Neste exemplo, a situação B, fornecerá uma imagem muito rica em detalhes, e fica patente que esta riqueza é fornecida pela AN da Objetiva e não pelo Poder de Aumento da Ocular utilizada.
Distância de Trabalho (WD)
Outra característica importante das Objetivas é sua Distância de Trabalho (WD). A WD é a distância entre a lente frontal de uma Objetiva e o topo da Lamínula ou da preparação histológica. Normalmente, quanto maior o Poder de Aumento de uma Objetiva, menor será a WD.
Oculares
Cada Ocular é composta por duas lentes convergentes, simples ou composta, uma superior, denominada lente ocular propriamente dita, e uma inferior, chamada lente de campo, ambas, montadas em  um  cilin-dro  metálico. A Ocular mais comumente usada é a do tipo Huygen, onde as lentes são plano-convexas tendo, a convexidade de ambas, voltada para a preparação histológica. Existem as Oculares de Ramsden, também formadas por lentes tipo plano-convexas, porém, com a convexidade para seu interior. As Ocula-res têm como função principal formar uma imagem Virtual, Aumentada e Direta, da imagem real dada  pela Objetiva. Além desta, corrigem pequenos defeitos da imagem que ainda persistem após passarem pelas Objetivas. No Corpo metálico (rosca superior), normalmente, podemos visualizar duas inscrições: H10X ou R10X ( a letra expressa o tipo de Ocular e o número, o Poder de Aumento da mesma ). As  Ocula-res  de 10X, em geral, apresentam  Número de Campo igual a 18 mm.  O  quociente: Número de Campo / Poder  de Aumento da Objetiva, nos fornecerá o Diâmetro do Campo de Visão. A Ocular  apresenta  em  seu interior, uma seta que  permite  apontar  qualquer estrutura no Campo de Visão.
Subplatina
Consta de um aro metálico, localizado abaixo da Platina, cuja função é a de sustentar ou prender, por meio de parafusos fixadores, parte dos componentes do Sistema de Iluminação (Filtro, Diafragma Íris e lentes do Condensador), podendo movê-la, no sentido norte-sul, através do parafuso do Condensador.
	Óptica
	Podemos subdividir a Parte Óptica em dois sistemas:
1. Formação e Ampliação da Imagem - compreende as objetivas e as oculares;
2. Iluminação - constituído pelo condensador (sistema de lentes, diafragma iris e filtro) e a fonte de luz incidente (lâmpada, sistema de lentes, espelho e diafragma de campo).
Iluminação
Consta de um aro metálico, localizado abaixo da Platina, cuja função é a de sustentar ou prender, por meio de parafusos fixadores, parte dos componentes do Sistema de Iluminação (Filtro, Diafragma Íris e lentes do Condensador), podendo movê-la, no sentido norte-sul, através do parafuso do Condensador.
Condensador
Conjunto de lentes montado num corpo metálico, situado abaixo da Platina do microscópio Óptico (preso a subplatina, por um parafuso de fixação), que concentra e fornece a luz necessária à iluminação do material em estudo. Os Condensadores mais usados são formados geralmente, por duas lentes: uma biconvexa (interna) e outra plano-convexa (superior), com face plana voltada para o orifício da platina. 
De acordo com o tipo de luz transmitida, temos Condensadores específicos: Campo-claro, Campo-escuro, Contraste de Fase e de Fluorescência. Quanto a correção óptica, os Condensadores assemelham-se às Ob-jetivas, havendo também, aqueles utilizados com Objetivas a seco, bem como, outros, usados com Objeti-vas de Imersão.
Embora negligenciado no cálculo do Limite de Resolução, o Condensador apresenta em seu Corpo Metáli-co, inscrições especificando o Tipo e a NA do mesmo. Na escolha de um Condensador é importante consi-derar sua NA, que deve ser equivalente ou superior à NA da Objetiva de maior aumento a ser utilizada (normalmente, NA do Condensador =1,32 para a objetiva de imersão em óleo).
Os Condensadores apresentam também, um sistema de palhetas plásticas - o Diafragma Iris, situado logo abaixo de seu sistema de lentes. É importante salientar que a abertura do Diafragma Iris é crítica para a formação da imagem; quando totalmente aberto, a qualidade da imagem perece, devido à reflexão da luz ao longo do trajeto óptico do microscópio. Se estiver muito fechado, obtém-se uma menor resolução e diminuição da nitidez.
Dessa forma, para cada Objetiva existe uma abertura ideal do Diafragma Iris e recomendamos regulá-la, sempre.
Filtros
Os filtros são utilizados para modificar a cor (cromáticos), a intensidade (cinza-neutros) ou capacidade térmica (catatérmicos), da luz que chega ao sistema óptico do microscópio. Os Filtros que mudam a cor (cromáticos) são mais frequentemente usados para acentuar o contraste da imagem; por exemplo, é co-mum utilizar-se Filtro Azul para fotografar material corado por Hematoxilina - Eosina.
O filtro azul converte a temperatura de cor da iluminação de halogênio na temperatura de cor da luz natu-ral, exibindo a amostra em suas cores naturais (diâmetro = 32,5 mm).
Fonte de Luz
Geralmente, os  Iluminadoresconsistem  de  uma lâmpada de 6 a 12 volts  e dois  sistemas  de lentes: um situado internamente na Base (formado por 3 a 4 lentes) e, outro (geralmente uma lente),  montado em um corpo metálico, localizado na parte anterior e externa, na Base, corretamente posicionados e definindo a trajetória óptica, no microscópio. Alguns equipamentos possuem o Iluminador situado na Base, próximo da inserção com a Coluna; quando emitem raios luminosos, eles são concentrados por um conjunto de lentes e desviados em sua trajetória horizontal, para outra, vertical, por um espelho, posicionado a 45°, em direção ao Condensador, espécime em estudo, objetivas, oculares (eixo óptico) e finalmente a retina de nossos olhos. Nos microscópios modernos, encontramos ainda, o Diafragma de Campo, semelhante em constituição ao Diafragma Iris, fica situado abaixo do sistema de lentes convergentes externo, porém, internamente na Base. A principal função dos Iluminadores é fornecer luz de qualidade e intensidade adequada para uma iluminação uniforme e eficiente do campo.
Oculares
A Ampliação final de um determinado espécime em observação, ao microscópio óptico pode ser expressa:
AUMENTO FINAL = Poder Aumento da OBJETIVA x Poder Aumento OCULAR
Deve ficar claro para o estudante que o AUMENTO de uma estrutura somente terá valor se houver conco-mitantemente, AUMENTO DE RESOLUÇÃO. Caso contrário, o Aumento será dito VAZIO, sem significado para as nossas proposições.