Aula dia 11 condições fisico-químicas para o cultivo de microrganismos

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BCFM - Condições químicas e físicas para o cultivo de microrganismos (11/12) 
 Qual a importância desse tema? 
- Dependendo do microrganismo vocês vão verificar que cada um vai ter uma 
condição diferente para seu crescimento. Então a importância de estudar esses 
métodos físico-químicos é justamente para você estudar esses microrganismos 
em laboratório, com isso fornecendo condições físicas e químicas adequadas 
ao metabolismo desses microrganismos. Porque eles são diferentes, então 
eles tem exigências nutricionais e condições diferentes. 
- O objetivo então é verificar o crescimento celular não só para identificação 
desse microrganismo, mas também para caracterização e também para o 
controle do crescimento. 
 
 Condições químicas: 
 Nutrientes: todo meio de cultura deve ter nutrientes básicos e esses 
nutrientes são usados para duas frentes principais: 
1. Para a síntese de diversos componentes celulares, tanto de 
procariotos como de eucariotos; =>metabolismo anabólico. 
2. Para obtenção de energia; =>metabolismo catabólico. 
- Você pode usar nutrientes com o objetivo de classificar microrganismos, 
porque existe uma grande diversidade de nutrientes disponíveis na natureza 
que são metabolizados ou não por diferentes tipos de microrganismos. 
- Essas diferentes classes tem exigências nutricionais típicas para cada 
espécies, uns são mais exigentes nutricionalmente e outros são menos. Então 
se necessita de condições diferenciais para diferentes microrganismos. 
- E também dependendo da localização, presença ou não desses nutrientes, 
no ambiente seja no solo, da água. 
- Esses nutrientes podem ser considerados de diferentes formas de acordo 
com suas exigências, podem ser: macronutrientes, micronutrientes e fatores de 
crescimento. 
 
 Macronutrientes: são nutrientes que são exigidos em grandes 
quantidades, nutrientes chaves para as funções celulares. 
Carbono- certa de 50% do peso seco de uma célula é composto de 
carbono, então ele é utilizado não só para a formação dos componentes 
estruturais da célula como fonte de energia. 
1. Quando a célula necessita de fontes de carbono para seus 
constituintes: 
- Fonte inorgânica, como o CO2 atmosférico, a célula então é 
autotrófica. 
- Fonte orgânica, como por exemplo, baseada em carboidratos/lipídios/ 
proteínas que é o nosso caso, a célula então é heterotrófica. 
2. Quando ela necessita de energia para catabolizar, para fazer 
funções celulares: 
-Se os compostos químicos forem orgânicos ou inorgânicos a célula é 
quimiotrófica. ( Qual a diferença de uma célula que utiliza compostos 
orgânicos ou inorgânicos? Se a célula utilizar compostos como fonte de 
energia orgânicos, ela vai ser uma célula quimiorganotrófica. Se utilizar 
um composto inorgânico é uma célula chamada quimiolitotrófica.). 
- Se a célula usa a luz é uma célula fototrófica, como por exemplo, 
bactérias, plantas etc. 
 
Segue a tabela que ele leu no áudio para resumir: 
 
 
 
Qual a importância de se estudar as bactérias quimioheterotróficas? 
- Na maioria das vezes são os microrganismos mais presentes; 
- Muitos são de importância médica, há várias bactérias que são patogênicas; 
- Tem importância industrial, não só na indústria alimentícia, mas também na 
degradação de poluentes como, por exemplo, pesticidas, plásticos e hidrocarbonetos. 
Várias bactérias são utilizadas para conter essa poluição ambiental; 
- Elas tem grande versatilidade de metabolismo, algumas bactérias usam 
exclusivamente glicose outras podem usar vários tipos de carboidratos e compostos 
orgânicos como a Pseudomonas que utiliza diferentes carboidratos, aminoácidos, 
hidrocarbonetos, pesticidas. 
-Essas bactérias quimioheterotróficas para obter esses compostos orgânicos, elas 
necessitam assimilar esses compostos espontaneamente (?). Então elas podem 
utilizar vários polímeros extracelulares, como por exemplo, o amido, a celulose, o 
glicogênio e o ácido hialurônico. Só que para isso ela precisa secretar algumas 
enzimas, enzimas essas que vão degradar os compostos em partículas menores, 
como por exemplo, a amilase, a celulase e a hialuronidase, ai sim a célula vai 
conseguir obter esses nutrientes. 
Segue tabela para facilitar a explicação: 
 
Nitrogênio - é outra classe de macronutrientes tão importante quanto o carbono. 
Ocupa cerca de 10 a 15% do peso seco de uma célula. Ele é presente em diversos 
compostos celulares como proteínas, carboidratos e ácidos nucleicos e que também 
podem ser utilizados não só como componentes estruturais, mas também para 
obtenção de energia. 
- Fontes inorgânicas de nitrogênio: N2, NO3-, NO2-, NH4. 
- Fontes orgânicas de nitrogênio: ureia, aminoácidos, peptídeos. Para se obter 
nitrogênio desses peptídeos é necessário enzimas hidrolíticas, enzimas extracelulares 
que vão degradar esses peptídeos em moléculas menores. 
Enxofre- outro macronutriente também utilizado como componente estrutural de 
proteínas e também para obtenção de energia. É obtido, assim como o nitrogênio de 
fontes orgânicas e inorgânicas. 
- Fontes inorgânicas de enxofre: SO42-, H2S. 
- Fontes orgânicas de enxofre: aminoácidos sulfurados (cisteína, metionina). 
* Nutrientes importantes em menor escala: 
Potássio- é requerido na síntese de várias enzimas, também é utilizado na síntese de 
proteínas. 
Magnésio- estabilização de ribossomos, membrana ac. Nucleicos e atividade 
enzimática. 
 
Cálcio- estabilização de paredes celulares e papel na termoestabilidade de 
endósporos. 
 
Ferro- componente de citocromos e ptns de transporte de elétrons. 
 
Fosfato- síntese de ac. Nucleicos e fosfolipídios. 
 
 Micronutrientes ou elementos de traço: são requeridos em poucas quantidades. 
Esses elementos podem ser obtidos na água ou em outros componentes. São 
eles: 
- Zinco: cofator para várias enzimas 
-Cobalto: vitamina B12 
-Manganês 
- Vn 
 
 Fatores de crescimento: compostos essenciais, que não são sintetizados pelos 
microrganismos. Não são utilizados para obtenção de energia, são utilizados 
em outros processos para a célula. Exemplos: aminoácidos, nucleotídeos e 
vitaminas. Em culturas de laboratório, tem certos microrganismos ou culturas 
animais que se você não acrescer esses fatores de crescimento elas não 
crescem, elas dependem muito desses fatores de crescimento. Dentre eles nós 
temos uma tabela com várias vitaminas: 
 
 
-Alguns microrganismos necessitam muito desses fatores de crescimento, porque 
muitos não sintetizam, outros sintetizam. 
- Quanto à necessidade desses fatores de crescimento, o organismo pode ser: 
1. Prototrófico: quando o microrganismo não necessita desses 
fatores de crescimento porque ele tem grande capacidade 
biossintética, como, por exemplo, os microrganismos do solo e 
da água. 
2. Auxotrófico: quando o microrganismo precisa de fatores de 
crescimento por ter menor capacidade biossintética e são mais 
exigentes nutricionalmente, como, por exemplo, microrganismos 
de alimentos, mucosas e sangue. No geral são microrganismos 
patogênicos. 
 
 
 
 
Entendendo quais são os componentes de um meio de cultura vamos entender o que 
é propriamente um meio de cultura. 
 
 Meios de cultura: são soluções nutricionais com grande quantidade de água e 
vários nutrientes essenciais para determinados tipos de microrganismos. Eles 
tem que ter pelo menos uma formulação básica com fontes de carbono 
nitrogênio e sair minerais. 
 
- Meio mínimo: é um meio relativamente básico que tem condições minimamente 
necessárias para o crescimento do microrganismo. Não apresenta fatores de 
crescimento e são utilizados para o crescimento de microrganismos prototróficos. 
 
- Meio definido: são meios em que você sabe exatamentea composição do meio, 
quando você vai fazer o meio você tem os compostos exatamente separados, como, 
por exemplo, se você colocar cinco gramas de glicose você esta sabendo quanto de 
glicose tem no meio assim como para sacarose, sódio etc. Ele é ideal para 
microrganismos auxotróficos de metabolismo conhecido porque a partir do momento 
que você conhece o metabolismo do microrganismo você sabe as exigências 
nutricionais dele. Então você pode acrescentar no meio de cultura todos os nutrientes 
fundamentais e básicos para que esse microrganismo prolifere. 
 
- Meio complexo: não tem uma composição química definida, geralmente são meios 
que tem vários extratos como, por exemplo, extratos peptídicos. Como exemplo, tem 
meios que levam fusão de várias coisas como cérebro e coração de carneiro, então 
você não sabe exatamente a quantidade de cada composto que tem ali. 
Exemplos: meios que usam sangue, extrato de levedura, extrato de carne, peptona, 
leite. Esses meios são utilizados para microrganismos auxotróficos que precisam de 
uma composição mais abrangente de nutrientes, ou seja, são mais exigentes 
nutricionalmente. 
 
Figura que ele usou como exemplo: 
 
Esses meios de cultura não só podem ser utilizados para o crescimento, mas também 
para diferenciação dos microrganismos. Nas aulas práticas de provas bioquímicas 
usamos meios seletivos ou diferenciais. 
- Meio seletivo: tem substâncias que vão inibir seletivamente o crescimento de certos 
microrganismos, eles vão fornecer o crescimento de alguns tipos de microrganismos 
em detrimento de outros. 
- Meio diferencial: contém indicadores que vão permitir a diferenciação dos 
microrganismos. 
 Ex: ágar eosina-azul de metileno (EAM), ele é tanto seletivo quanto diferencial. Ele é 
seletivo porque possui o azul de metileno que vai impedir o crescimento de gram 
positivos, favorecendo o crescimento de bactérias gram negativas. E ele é diferencial 
porque ele não tem glicose aqui ele tem sacarose e outro carboidrato e dependendo 
da bactéria que vai estar aqui vai metabolizar ou não produzindo ou não ácidos, se 
tiver pouca produção de ácido a colônia vai ficar quase transparente (1ª da esquerda 
pra direita), se tiver uma produção mais intermediária fica dessa cor (2ª da esquerda 
pra direita) e se tiver muita produção de ácido elas ficam nesse verde mais metalizado. 
Esse meio é muito utilizado para o crescimento de enterobactérias, porque 
dependendo da bactéria a gente vai ver um perfil diferente de colônia. 
 
 Existem bactérias que não crescem em nenhum meio de cultura, na verdade 
há uma estimativa de que apenas 5% dos microrganismos são cultivados em 
laboratório. Então a grande maioria não é cultivável, não conhecemos a grande 
maioria das bactérias. Porque elas não crescem? Porque há falta de um meio 
de cultura universal, há necessidade de grandes quantidades de fatores de 
crescimento, geralmente são patógenos intracelulares obrigatórios, é preciso o 
uso de culturas de células, animais de laboratórios e ovos embrionários. 
 Ex: Treponema pallidum, causador da sífilis, que tem uma exigência 
nutricional muito grande. 
 
 Outro exemplo de cultura é a cultura de células animais que precisam de muito 
cuidado de manuseio, ela são muito mais “frescas” do que muitos 
microrganismos. As células são muito exigentes nutricionalmente 
 
 Condições físicas: são condições que juntamente com os nutrientes são 
necessárias para o cultivo de microrganismos. 
 Temperatura: é a condição mais importante para o cultivo de 
microrganismos. A faixa de temperatura ideal é de 25 a 40ºC. A 
temperatura é importante porque quanto menor a temperatura, menor a 
atividade enzimática dessas enzimas e são as enzimas que catalisam 
as reações bioquímicas dentro da célula, então se você não tem enzima 
metabolicamente ativa você vai ter reações metabólicas desaceleradas 
ou nulas. Então quanto maior a temperatura, mais energia cinética você 
vai fornecer e maior é a atividade dessas enzimas. 
 
Gráfico que ele usou pra explicar (se quiserem ouvir no áudio esta em 
26:15): 
 
 
 
 
 
 
- Classificação quanto à temperatura de crescimento: 
 
*Ele explica o gráfico no áudio mais depois fala de cada um. 
Psicrófilos- geralmente tem um crescimento abaixo de 20ºC, com crescimento ótimo 
em 15º. São geralmente bactérias e arqueas do Ártico, Antártica e oceanos. Eles tem 
uma limitação porque necessitam da presença de água no estado líquido, porque 
tendo água eles conseguem sobreviver e se proliferar. 
Mesófilos- tem um crescimento entre 20 e 40ºC, que é geralmente o que a gente 
trabalha em laboratório. São geralmente microrganismos patogênicos, que sobrevivem 
a 36ºC que é nossa temperatura corpórea. E alguns desses microrganismos mesófilos 
podem crescer em temperaturas baixas de 0 até 4ºC, só que obviamente a 
temperatura ótima é entre 20 e 40ºc, esses microrganismos são chamados de 
pscicrotolerantes e são muito presentes, por exemplo, na deterioração de alimentos. 
Termófilos- são muito comuns de áreas de atividade vulcânica. Tem um crescimento 
de 40 a 80ºC, são geralmente bactérias e arqueas do solo. 
Hipertermófilos-são extremófilos, que podem crescer acima de 80°C, alguns crescem 
até acima de 100ºC. São geralmente arqueas de fontes termais e gêiseres. 
Tabela resumindo as temperaturas mínimas, ótimas e máximas de algumas bactérias: 
 
 Adaptações a baixas temperaturas: 
- As enzimas desses microrganismos tem proteínas com estrutura 
predominante em α-hélice, enquanto microrganismos mesófilos tem proteínas 
em estrutura beta-pragueada. Essa estrutura em α-hélice que torna a 
proteína/enzima mais maleável, que em baixas temperaturas é importante 
porque quando você reduz à temperatura as enzimas tendem a ter uma menor 
atividade enzimática, então quando você tem estruturas em α-hélice ela fica 
mais maleável e consegue ter atividade nessas baixas temperaturas. 
- Essas enzimas também tem um maior número de aminoácidos polares, o que 
é bom em ambiente altamente polar no citoplasma. 
- A membrana plasmática desses microrganismos possui muitos ácidos graxos 
insaturados, no geral a membrana celular de bactérias tem ácidos graxos 
saturados, só que baixas temperaturas você precisa de ácidos graxos 
insaturados para manter a membrana mais fluida e as atividades celulares 
continuarem. 
 Adaptações a altas temperaturas: 
- No geral, as enzimas dos microrganismos de altas temperaturas e os normais 
não tem muita diferença, com exceção na localização de alguns aminoácidos, 
esses aminoácidos vão permitir que essas proteínas não se desnaturem que 
elas tenham essa conformação dobrada ali de forma mais estável. 
- As proteínas possuem aminoácidos hidrofóbicos no interior da estrutura, 
dando uma forma, mas enrijecida a ela quando o ambiente está muito 
termolábel. 
- Esses microrganismos tem alto teor de GC nos seus ácidos nucleicos e 
quando maior o teor de GC mais energia é preciso para quebrar as ligações. 
- Contrariamente aos microrganismos que vivem em baixas temperaturas, os 
hipertermófilos possuem muitos ácidos graxos saturados o que permite a 
membrana ficar mais rígida frente a essas altas temperaturas que poderiam 
derreter a membrana. 
- Além disso, nós temos a presença em arqueas, por exemplo, de uma 
membrana que é diferente que não é uma bicamada lipídica e sim uma 
monocamada, e essa monocamada possui cadeias de isopreno que são 
ligadas por ligações do tipo éter ao glicerol, são ligações mais rígidas. Uma 
monocamada é muito mais difícil de desestruturar do que uma bicamada 
lipídica. 
 
 pH: quanto ao pH do meio os microrganismos podem ser acidófilos, 
neutrófilosou alcalifílico. 
Acidófilos- sobrevivem em pH abaixo de 6,5. Fungos, bactérias e arqueas são bem 
adaptados a essas condições de pH. São presentes em certos alimentos e mucosas. 
Neutrófilos- crescem em ambiente de pH neutro, entre 6,5 e 8,5. São geralmente 
células mamíferas, protozoários e bactérias patogênicas. 
Alcalifílicos-crescem em pH acima de 8,5. São microrganismos que vivem em solos e 
lagos com altas quantidades de carbonato, são geralmente bactérias e arqueas. Tem 
uma aplicação industrial muito importante, porque elas produzem enzimas 
extracelulares, por exemplo, utilizadas na indústria de detergentes, essas enzimas vão 
atuar melhor nesse ambiente alcalino. 
 
- Figura dizendo a presença de determinados microrganismos em determinados 
alimentos/ambientes de acordo com o pH. 
 
- Figura resumindo os pHs mínimos, ótimos e máximos de alguns microrganismos. 
 Da mesma forma que os microrganismos desenvolveram habilidades para 
superar temperaturas altas e baixas, eles também desenvolveram algumas 
habilidades para se manter em ambientes de pH diferentes. No geral, o pH dos 
microrganismos nas células é mais pra neutralidade, geralmente de 5 a 9, 
sempre vão ter alguns com pH menos de 4,5 e outros de quase 10. Esses 
extremos são importantes de ser respeitados porque os RNAs, eles não 
sobreviviam em condições básicas e os DNAs em condições ácidas, então 
para manter esse pH mais próximo da neutralidade as células dependem de 
vários fatores. Então, por exemplo, se você tem uma bactéria que não 
sobreviva em ambiente ácido, ela vai então colocar H+ para fora, hidrogênio 
esse que vai acidificar seu pH interno, ela possui também outros cofatores que 
também colocam H+ pra fora e também nas suas proteínas do complexo 
respiratório elas vão jogar muito H+ pra fora que é o que é feito na cadeia 
transportadora de elétrons. 
Num desafio alcalino, então, ocorre o contrário as proteínas de transporte vão 
colocar sódio pra fora e H+ pra dentro. 
 
 O2(potencial de oxi-redução): outro fator importante é a presença ou 
não de oxigênio. 
- Microrganismos aeróbios obrigatórios: há necessidade da presença de 
O2, que é o melhor aceptor final de elétrons da cadeia respiratória na 
respiração aeróbia. No entanto, esse metabolismo do O2 ele não é só 
bom pelo aceptor de elétrons, mas também é ruim porque produz 
diversos compostos, espécies reativas de oxigênio que são muito 
tóxicas para a célula. Dentre essas espécies nós temos o superóxido, o 
peróxido de hidrogênio e radicais hidroxil. Para conseguir remover 
esses radicais livres há a presença de 3 enzimas na célula, uma delas é 
a catalise-a peroxidase e a superóxido dismutase(SOD). Então são 
essas enzimas que vão, como por exemplo a catalase, degradar o 
peróxido de hidrogênio(altamente prejudicial) em água(H2O) e O2, 
assim como a peroxidade, a superóxido dismutase(SOD) e em alguns 
microrganismos elas podem até atuar em conjunto. 
 
Imagem de exemplo: 
 
-Microrganismo aeróbio microaerófilo: necessitam de pequenas quantidades de O2, 
bem menos que os aeróbios obrigatórios. Presença de moléculas sensíveis a altos 
níveis de O2. 
-Microrganismo anaeróbio: tem sobrevivência apenas na ausência de O2. Eles podem 
tolerar o oxigênio e alguns não, pode ser letal. Nos aerotolerantes, eles toleram 
pequenas quantidades de O2, mas não utilizam o oxigênio eles removem esse O2 
pela oxidação de compostos orgânicos, como glicose para ácido glicônico. E nos 
anaeróbios restritos o O2 é letal porque eles não possuem aquelas enzimas( SOD, 
peroxidase e catalase) para remover os compostos tóxicos. 
- Microrganismo facultativo: ele pode ter crescimento tanto na presença quanto na 
ausência de O2, porque possui um metabolismo bastante versátil. E se ele cresce 
também na presença de O2 ele tem que ter alguns mecanismos de defesa que é a 
presença de SOD, peroxidase e catalase. 
Tabela que ele leu no áudio( se quiserem ouvir está em 49:06):
 
Experimento que ele usou pra explicar qual tipo de microrganismo está presente em 
cada tubo: 
 
No experimento foram usados 5 tubos com meio de cultura com Tioglicolato(que 
remove o oxigênio, transformando-o em água), Resazurina(indicador redox, quando se 
tem a presença de oxigênio o meio muda ficando com o aspecto rosa) e pequena 
quantidade de ágar. Se você inocula as bactérias nesses tubos, que tipo de bactérias 
seriam essas? 
a) Aeróbio- pois só tem oxigênio na parte de cima então ela vai crescer próximo 
da superfície onde está o oxigênio. 
b) Anaeróbio- o crescimento é longe do oxigênio. 
c) Aeróbio facultativo-pois cresce tanto na presença de O2 quanto na ausência. 
No entanto, ele vai crescer um pouco mais perto da superfície, onde tem 
oxigênio porque gera mais energia para a célula. 
d) Microaerófilo- porque ele metaboliza pouco com poucas quantidades de 
oxigênio. 
e) Anaeróbio aerotolerante-crescem o meio todo porque eles toleram o oxigênio. 
 
 Para se trabalhar com bactérias anaeróbias é preciso condições especiais, 
uma delas é usar o meio Tioglicolato que “sequestra” o oxigênio, a outra é 
trabalhar com jarras de anaerobiose e câmara de anaerobiose, esses aparatos 
removem o O2 e o substituem por H2 e CO2, ou seja, transformando aquele 
ambiente altamente aeróbio em um ambiente anaeróbio. 
 
 Osmolaridade: outro fator importante é a osmolaridade, ou seja, a 
quantidade de soluto que tem no meio. Esses microrganismos podem 
ser: 
Halotolerantes: toleram até 7,5 a 10% de sódio. 
Halófilos: toleram até 30% de NaCL. Podem ser discretos( requerem 
até 6% de sal) ou moderados( até 15%). 
Halófilos extremos: vivem em concentrações de sal de 30% ou mais. 
 
-A osmolaridade é importante porque a partir da quantidade de soluto 
no meio você vai saber qual a disponibilidade de água livre no meio. 
Essa disponibilidade de água é chamada de atividade de água(Tw). A 
importância dessa água livre é que a célula depende de água pra 
exercer suas funções, dentre elas a atuação de suas enzimas. Essa 
atividade de água é calculada através de uma razão e essa razão 
sempre varia de 0 a 1, onde, por exemplo, a água pura(sem soluto 
algum) você teria então uma atividade de água de 1 e outros produtos 
como, por exemplo, cereais você teria uma disponibilidade de água de 
0,7. 
- Isso é importante por conta dos transporte de membrana, como a 
osmose, que é a passagem da água do meio menos concentrado para 
o mais concentrado, para equilibrar as concentrações. Isso é importante 
porque as células podem viver em meio isotônico(concentrações iguais 
de soluto no meio externo e interno), meio hipotônico(onde há uma 
entrada de água na célula, o que pode romper a membrana) ou meio 
hipertônico(onde a tendência da célula é perder água). No caso dos 
meios hipertônicos, onde há perda de atividade de água, alguns 
microrganismos desenvolveram maneiras de contrabalancear isso: 
adicionando solutos para dentro da célula, como o HCL, ou então 
produzindo algumas substâncias como glicina, manitol, betanina que é 
característica de algumas bactérias. Algumas arqueas produzem 
heteropolissacarídeo sulfatado que se ligam a alta concentração de 
sódio presente externamente. 
 
 
 
 
Figuras para exemplificar osmose: