PCR - Aula 3

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PCR	
  –	
  Polymerase	
  Chain	
  Reac2on	
  
Profa.	
  Dra.	
  Mariana	
  Melo	
  
Faculdade	
  Maurício	
  de	
  Nassau	
  
PCR	
  
•  Reação	
  em	
  cadeia	
  da	
  polimerase	
  
•  Técnica	
  que	
  permite	
  clonar	
  (copiar)	
  um	
  fragmento	
  de	
  
DNA	
  –	
  amplificação	
  
•  Alta	
  sensibilidade,	
  alta	
  especificidade	
  
•  Aplicações:	
  pesquisa,	
  diagnós2co,	
  estudos	
  
epidemiológicos,	
  caracterização	
  de	
  microorganismos	
  	
  
–  Situações	
  em	
  que	
  há	
  pequenas	
  quan2dades	
  de	
  DNA	
  para	
  
serem	
  analisadas	
  
EM	
  QUE	
  CONSISTE	
  A	
  PCR?	
  
•  Consiste	
  em	
  separar	
  o	
  dsDNA	
  em	
  ssDNA,	
  
adicionar	
  primers	
  (iniciadores)	
  cujas	
  
sequências	
  sejam	
  conhecidas	
  e,	
  na	
  presença	
  
de	
  uma	
  DNA	
  polimerase,	
  copiar	
  os	
  segmentos	
  
de	
  DNA	
  repe2das	
  vezes	
  
•  Cada	
  vez	
  que	
  as	
  cópias	
  são	
  produzidas,	
  tem-­‐se	
  
um	
  ciclo	
  
Componentes	
  da	
  PCR	
  
•  Amostra	
  de	
  DNA	
  
•  Mistura	
  contendo:	
  
–  Água	
  ultra-­‐pura	
  
–  4	
  desoxinucleoWdeos	
  
•  DNA	
  polimerase	
  em	
  solução	
  tampão	
  
–  Taq	
  polimerase	
  
•  MgCl2	
  –	
  cloreto	
  de	
  magnésio:	
  co-­‐fator	
  
•  Iniciadores	
  (Primers)	
  
Ciclos	
  da	
  PCR	
  
•  Combinação	
  adequada	
  de	
  temperatura	
  e	
  
tempo	
  
•  3	
  fases:	
  
– Desnaturação	
  
– Anelamento	
  
– Extensão	
  
•  Termociclador	
  
Ciclos	
  da	
  PCR	
  
Desnaturação	
  	
  
•  Fase	
  em	
  que	
  o	
  DNA	
  perde	
  sua	
  estrutura	
  fita	
  
dupla	
  e	
  se	
  torna	
  fita	
  simples	
  
	
  
•  Temperatura:	
  em	
  torno	
  de	
  95oC	
  
•  Baixas	
  concentrações	
  das	
  fitas	
  
complementares	
  –	
  diminuem	
  a	
  chance	
  de	
  
reformação	
  da	
  fita	
  dupla	
  
Anelamento	
  
•  Redução	
  da	
  temperatura	
  →	
  pareamento	
  dos	
  
primers	
  com	
  as	
  sequências	
  complementares	
  
•  A	
  temperatura	
  dessa	
  fase	
  depende	
  de	
  cada	
  
primer	
  ou	
  conjunto	
  de	
  primers	
  
•  Tamanho	
  e	
  sequência	
  específica	
  de	
  cada	
  
primer	
  influenciam	
  na	
  temperatura	
  
Extensão	
  
•  Temperatura:	
  por	
  volta	
  de72oC	
  
•  Ação	
  da	
  DNA	
  polimerase:	
  
– Síntese	
  de	
  uma	
  nova	
  fita	
  de	
  DNA	
  
– Requerimento	
  da	
  presença	
  de	
  Mg	
  
•  U2lização	
  do	
  desoxinucleoWdeos	
  adicionados	
  
à	
  solução	
  tampão	
  
E	
  depois	
  do	
  primeiro	
  ciclo?	
  
•  Repe2ção	
  dos	
  ciclos	
  
– 20	
  a	
  40	
  vezes	
  
•  Porque	
  não	
  mais	
  que	
  40	
  repe2ções?	
  
– Perda	
  da	
  especificidade	
  
PCR	
  Nested	
  
•  Nested	
  PCR:	
  	
  
–  reação	
  u2lizada	
  para	
  amplificar	
  sequências	
  específicas	
  que	
  
estejam	
  misturadas	
  a	
  muitas	
  outras	
  sequências	
  
–  mais	
  específico	
  que	
  a	
  PCR	
  comum	
  
•  Envolve	
  o	
  uso	
  de	
  dois	
  pares	
  de	
  primers	
  
–  Outer	
  primer	
  
–  Inner	
  primer	
  
•  Reações	
  podem	
  ser	
  concomitantes	
  ou	
  sequenciais	
  
•  Muito	
  usada	
  quando	
  o	
  genoma	
  do	
  organismo	
  não	
  está	
  
completamente	
  sequenciado	
  
Nested-­‐PCR	
  
PCR	
  +	
  RAPD	
  
•  RAPD:	
  amplificação	
  de	
  DNA	
  ao	
  acaso	
  
•  Muito	
  u2lizada	
  para	
  regiões	
  de	
  sequências	
  
repe22vas	
  –	
  espécie	
  específicas	
  
•  Estudos	
  de	
  polimorfismos	
  
•  Construção	
  de	
  primers	
  específicos	
  
PCR	
  Mul2plex	
  
•  U2lização	
  de	
  vários	
  conjuntos	
  de	
  primers	
  
•  Amplificação	
  de	
  mais	
  de	
  uma	
  sequência-­‐alvo	
  
•  Diagnós2co	
  de	
  parasitas	
  que	
  mantêm	
  
populações	
  reduzidas	
  nos	
  hospedeiros	
  ou	
  cuja	
  
dis2nção	
  morfológica	
  seja	
  digcil	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  
•  PCR	
  quan2ta2vo:	
  es2mar	
  a	
  quan2dade	
  de	
  DNA	
  
resultante	
  da	
  reação	
  
•  Para	
  es2mar	
  a	
  quan2dade	
  de	
  DNA	
  resultante,	
  
usa-­‐se:	
  
–  Corantes	
  específicos	
  –	
  SYBR	
  Green	
  
–  Sondas	
  radioa2vas	
  
•  hjp://www.youtube.com/watch?v=Or83QaIFHjU	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  
•  U2lizado	
  para	
  detectar	
  expressão	
  gênica	
  
•  Extração	
  de	
  RNAm	
  (mensageiro)	
  
•  U2lização	
  da	
  transcriptase	
  reversa:	
  enzima	
  
que	
  sinte2za	
  DNA	
  complementar	
  (cDNA)	
  a	
  
par2r	
  de	
  moléculas	
  de	
  RNA	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  –	
  exemplo	
  de	
  
aplicação	
  
•  Diagnós2co	
  e	
  tratamento	
  da	
  Leucemia	
  Mielóide	
  
Crônica	
  
•  Leucemia	
  Mielóide	
  Crônica:	
  doença	
  clonal	
  
maligna,	
  caracterizada	
  por	
  uma	
  excessiva	
  
proliferação	
  da	
  linhagem	
  de	
  células	
  mielóides	
  
(fase	
  crônica),	
  seguida	
  de	
  perda	
  de	
  diferenciação	
  
celular	
  (fase	
  acelerada),	
  chegando	
  num	
  quadro	
  
de	
  leucemia	
  aguda	
  (fase	
  blás2ca).	
  
	
  
	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  –	
  exemplo	
  de	
  
aplicação	
  
•  Cromossomo	
  Philadelphia	
  –	
  translocação	
  
recíproca	
  entre	
  os	
  braços	
  longos	
  dos	
  
cromossomos	
  9	
  e	
  22	
  [t(9;22)]	
  
•  Gene	
  híbrido	
  (também	
  chamado	
  quimérico)	
  BCR-­‐
ABL	
  
•  PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  
–  Extração	
  do	
  transcrito	
  do	
  gene	
  BCR-­‐ABL	
  
–  U2lização	
  da	
  transcriptase	
  reversa:	
  síntese	
  de	
  cDNA	
  a	
  
par2r	
  dos	
  transcritos	
  do	
  BCR-­‐ABL	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  –	
  exemplo	
  de	
  
aplicação	
  
•  U2lização	
  de	
  primers	
  específicos	
  para	
  o	
  BCR-­‐
ABL	
  e	
  sondas	
  fluorescentes	
  específicas	
  para	
  o	
  
BCR-­‐ABL	
  
– Detecção	
  do	
  gene	
  BCR-­‐ABL	
  –	
  os	
  primers	
  só	
  se	
  
anelarão	
  se	
  o	
  gene	
  es2ver	
  presente	
  
– Avaliação	
  de	
  resposta	
  ao	
  tratamento	
  –	
  emissão	
  de	
  
fluorescência	
  pelas	
  sondas	
  (quanto	
  maior	
  a	
  
quan2dade	
  de	
  material	
  amplificado,	
  maior	
  a	
  
emissão	
  de	
  fluorescência)