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Confecção de Primers - Aula 4

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Design	
  de	
  Primers	
  
Profa.	
  Dra.	
  Mariana	
  Melo	
  
Faculdade	
  Maurício	
  de	
  Nassau	
  
Primer	
  (Iniciador)	
  
•  Sequência	
  de	
  nucleo=deos	
  u>lizada	
  em	
  técnicas	
  
como	
  PCR	
  e	
  sequenciamento	
  de	
  DNA	
  
•  Sinte>zados	
  em	
  laboratórios	
  
•  Função:	
  assim	
  como	
  os	
  primers	
  sinte>zados	
  pela	
  
enzima	
  primase	
  durante	
  o	
  processo	
  de	
  
replicação,	
  os	
  primers	
  sinté>cos	
  têm	
  a	
  função	
  de	
  
fornecer	
  uma	
  extremidade	
  3’	
  a	
  par>r	
  da	
  qual	
  a	
  
DNA	
  polimerase	
  (Taq	
  polimerase)	
  pode	
  iniciar	
  a	
  
adição	
  de	
  nucleo=deos	
  
O	
  que	
  levar	
  em	
  consideração	
  ao	
  fazer	
  
o	
  design	
  do	
  primer?	
  
•  Tm	
  –	
  temperatura	
  de	
  desnaturação:	
  
temperatura	
  em	
  que	
  metade	
  da	
  fita	
  dupla	
  se	
  
dissocia	
  e	
  forma	
  ssDNA	
  
– Existem	
  programas	
  específicos	
  para	
  calcular	
  Tm	
  
•  Probabilidade	
  de	
  pareamentos	
  não-­‐desejados	
  
–  loops,	
  hairpins	
  
– dímeros	
  
•  Comprimento:	
  entre	
  17	
  e	
  28	
  nucleo=deos	
  
– Especificidade	
  
•  Evitar	
  sequências	
  poliA,	
  poliT,	
  poliC,	
  poliG,	
  
polipirimidinas	
  (T,C)	
  e	
  polipurinas	
  (A,G)	
  
– 50%	
  GC	
  
•  Final	
  3’	
  do	
  primer	
  deve	
  sempre	
  ser	
  G	
  ou	
  C	
  
– Pontes	
  de	
  Hidrogênio	
  
O	
  que	
  levar	
  em	
  consideração	
  ao	
  fazer	
  
o	
  design	
  do	
  primer?	
  
Programas	
  de	
  Computador	
  
•  Sequência	
  a	
  ser	
  amplificada	
  
–  Genes	
  de	
  interesse	
  
–  GeneBank:	
  banco	
  de	
  dados	
  com	
  sequências	
  de	
  genomas	
  já	
  
conhecidos	
  
•  Cálculo	
  das	
  temperaturas	
  
–  De	
  desnaturação	
  
–  De	
  anelamento	
  
•  Determinação	
  da	
  especificidade	
  do	
  primer	
  
–  BLAST	
  –	
  Basic	
  Local	
  Alignment	
  Search	
  Tool

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