Eletroforese - Aula 5

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Eletroforese	
  
Profa.	
  Dra.	
  Mariana	
  Melo	
  
Faculdade	
  Maurício	
  de	
  Nassau	
  
Definição	
  
•  Técnica	
  u<lizada	
  para	
  iden<ficar,	
  separar	
  e	
  
purificar	
  macromoléculas	
  
–  Proteinas	
  
–  Ácidos	
  nucleicos	
  
•  DNA	
  fragmentado	
  com	
  enzimas	
  de	
  restrição	
  
•  Movimento	
  de	
  parEculas	
  eletricamente	
  
carregadas	
  em	
  um	
  meio,	
  sob	
  influência	
  de	
  um	
  
campo	
  elétrico	
  
–  Tamanho	
  da	
  molécula	
  
–  Carga	
  elétrica	
  
–  Conformação	
  
Como	
  acontece	
  essa	
  separação?	
  
Meio	
  Lsico	
  
•  Papel	
  filtro	
  
•  Sílica-­‐gel	
  
•  Membranas	
  de	
  celulose	
  
•  Gel	
  de	
  agarose	
  
•  Gel	
  de	
  amido	
  
•  Gel	
  de	
  poliacrilamida	
  
•  Proteínas	
  –	
  moléculas	
  anfóteras	
  
– Necessidade	
  de	
  estabilizar	
  o	
  pH	
  
– Solução	
  tampão	
  
•  Ácidos	
  Nucleicos	
  
– Moléculas	
  nega<vas	
  
– Migram	
  em	
  direção	
  ao	
  pólo	
  posi<vo	
  
Solução	
  Tampão	
  
•  Sistema	
  tampão	
  
– Preparação	
  do	
  gel	
  
– Tampão	
  da	
  cuba	
  eletrolí<ca	
  
•  ConEnuo	
  versus	
  desconEnuo	
  
•  TAE	
  –	
  tampão	
  tris-­‐acetato-­‐EDTA	
  
•  TBE	
  –	
  tris-­‐borato-­‐EDTA	
  
Eletroforese	
  em	
  gel	
  de	
  agarose	
  
•  Preparação	
  do	
  gel	
  
•  Aplicação	
  das	
  amostras	
  e	
  
migração	
  
•  Coloração	
  (corante:	
  
brometo	
  de	
  eEdio)	
  
Fatores	
  que	
  afetam	
  a	
  migração	
  no	
  gel	
  
de	
  agarose	
  
•  Concentração	
  da	
  agarose	
  
•  Conformação	
  do	
  DNA	
  
•  Intensidade	
  da	
  corrente	
  (voltagem)	
  
Eletroforese	
  em	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  
(SDS-­‐PAGE)	
  
•  Tratamento	
  
com	
  SDS	
  
(dodecil	
  sulfato	
  
de	
  sódio)	
  
•  Aplicação	
  no	
  
topo	
  do	
  gel	
  
•  Migração	
  
Eletroforese	
  em	
  sistema	
  capilar	
  
•  Separação	
  de	
  moléculas	
  em	
  tubos	
  capilares	
  
–  15	
  a	
  100	
  μm	
  diâmetro	
  interno	
  
–  36	
  a	
  100	
  cm	
  de	
  comprimento	
  
•  Tratamento	
  com	
  formamida:	
  estabilização	
  do	
  DNA	
  
•  Vantagens	
  
–  Aplicação	
  de	
  voltagens	
  maiores	
  –	
  dissipação	
  do	
  calor	
  
gerado	
  pela	
  corrente	
  elétrica	
  
–  Análise	
  de	
  grande	
  número	
  de	
  amostras	
  ao	
  mesmo	
  
tempo	
  
Aparelho	
  de	
  eletroforese	
  capilar	
  
§ Fonte	
  de	
  alta	
  tensão	
  
§ Capilares	
  
§ Eletrodos	
  
§ Detector	
  
Qual	
  é	
  o	
  resultado	
  de	
  uma	
  
eletroforese?	
  
Eletroferograma	
  
Aplicações	
  prá<cas	
  
•  Iden<ficação	
  de	
  paternidade	
  
Aplicações	
  prá<cas	
  
•  Iden<ficação	
  de	
  criminosos