Tecnologia do DNA Recombinante - Aula 8

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Tecnologia	
  do	
  DNA	
  
recombinante	
  e	
  clonagem	
  
Profa.	
  Mariana	
  Melo	
  
Faculdade	
  Maurício	
  de	
  Nassau	
  
O	
  que	
  é	
  tecnologia	
  do	
  DNA	
  
recombinante	
  
•  Tecnologias	
  que	
  levam	
  à	
  formação	
  de	
  moléculas	
  
de	
  DNA	
  provenientes	
  de	
  duas	
  fontes	
  diferentes	
  
•  Junção	
  não	
  natural	
  
•  Enzimas	
  
–  Enzimas	
  de	
  restrição	
  (endonucleases	
  de	
  restrição)	
  
–  DNA	
  ligases	
  
Enzimas	
  de	
  restrição	
  
•  Enzimas	
  que	
  reconhecem	
  sequências	
  curtas	
  de	
  
DNA	
  e	
  clivam	
  a	
  molécula	
  nessas	
  sequências	
  
–  4	
  a	
  8	
  nucleoLdeos	
  
–  Algumas	
  enzimas	
  de	
  restrição	
  fazem	
  a	
  meMlação	
  das	
  
extremidades	
  da	
  molécula	
  de	
  DNA	
  
•  Isoladas	
  de	
  bactérias	
  –	
  clivagem	
  de	
  DNA	
  
exógenos	
  (bacteriófagos)	
  
•  Cada	
  enzima	
  de	
  restrição	
  reconhece	
  apenas	
  uma	
  
sequência	
  de	
  nucleoLdeos	
  
Enzimas	
  de	
  restrição	
  
•  Sequência	
  de	
  reconhecimento:	
  sequência	
  de	
  
pares	
  de	
  base	
  onde	
  a	
  enzima	
  de	
  restrição	
  se	
  
liga	
  na	
  molécula	
  de	
  DNA	
  
•  Clivagem:	
  pode	
  acontecer	
  na	
  sequência	
  de	
  
reconhecimento	
  ou	
  próximo	
  a	
  ela	
  
– Simétrica	
  
– Assimétrica	
  
Clivagem	
  Simétrica	
   Clivagem	
  assimétrica	
  
Enzimas	
  de	
  restrição	
  
Extração	
  de	
  DNA	
  
•  Cultura	
  das	
  células	
  
•  Lise	
  das	
  células	
  
•  Remoção	
  dos	
  demais	
  componentes	
  celulares	
  
•  Precipitação	
  do	
  DNA	
  
•  Lise	
  das	
  células	
  
– Solução	
  tampão	
  contendo:	
  
•  Lisozimas	
  
•  EDTA	
  
•  Sódio	
  Dodecil	
  Sulfato	
  (SDS)	
  
•  Separação	
  do	
  DNA	
  dos	
  demais	
  componentes	
  
da	
  células	
  
– Fenol	
  e	
  clorofórmio	
  
– Enzimas	
  proteolíMcas	
  (proteinase	
  K)	
  
•  Etanol	
  e	
  RNAse	
  
Hibridização	
  
•  Anelamento	
  entre	
  fitas	
  de	
  ssDNA	
  de	
  origens	
  
diferentes	
  
•  Sondas	
  de	
  DNA	
  
– Sequências	
  definidas	
  
– SinteMzadas	
  em	
  laboratório	
  
– Marcadas	
  para	
  facilitar	
  a	
  idenMficação	
  
Para	
  que	
  se	
  uMliza	
  a	
  hibridização?	
  
§  Para	
  idenMficar	
  segmentos	
  de	
  DNA	
  e	
  RNA	
  
separados	
  por	
  eletroforese	
  
•  Southern	
  blot	
  
•  Northern	
  blot	
  
Southern	
  Blot	
  
Northern	
  blot	
  
Clonagem	
  
•  Inserto	
  de	
  DNA	
  
•  DNA	
  recombinante	
  
•  Vetor	
  
–  Conter	
  uma	
  origem	
  de	
  replicação	
  
–  Conter	
  uma	
  marca	
  de	
  seleção	
  
–  Apresentar	
  síMo	
  único	
  para	
  a	
  enzima	
  de	
  restrição	
  
uMlizada	
  
Vetores	
  plasmidiais	
  
•  Plasmídeos:	
  moléculas	
  pequenas	
  de	
  DNA	
  
circular	
  
	
  
Vetores	
  bacteriófagos	
  
•  Bacteriófagos:	
  vírus	
  que	
  infectam	
  bactérias	
  
Transformação	
  
•  Processo	
  através	
  do	
  qual	
  um	
  organismo	
  
hospedeiro	
  incorpora	
  DNA	
  do	
  ambiente	
  
•  Competência	
  
– GenéMca	
  
– Adquirida	
  
•  Ineficiência	
  da	
  transformação	
  
Transformação	
  
Bibliotecas	
  de	
  DNA	
  
•  População	
  de	
  vetores	
  idênMcos,	
  que	
  contêm	
  
insertos	
  diferentes	
  de	
  um	
  DNA	
  alvo	
  
•  Bibliotecas	
  genômicas	
  
	
  
•  Bibliotecas	
  de	
  cDNA	
  
–  Isolamento	
  de	
  RNAm	
  
– UMlização	
  da	
  transcriptase	
  reversa	
  
Como	
  isolar	
  clones	
  específicos	
  de	
  uma	
  
biblioteca	
  de	
  DNA?	
  
•  Hibridização	
  em	
  colônia	
  
– Transferência	
  das	
  colônias	
  para	
  membranas	
  
posiMvamente	
  carregadas	
  
– Lise	
  das	
  células	
  
– Hibridização	
  com	
  a	
  sonda