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Análise de Proteína Bromatologia Prof. Msc Vinicius Rodrigues Março/2015 Definição São polímeros de alto peso molecular, cujas unidades básicas são compostas por moléculas de α- aminoácidos ligadas através de ligações peptídicas. Proteínas Aminoácidos Proteína Maiores constituintes de toda a célula viva, cada uma com uma função associada as atividades vitais; Nos alimentos, além da função nutricional, possui propriedades sensoriais e de textura; Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos. Proteína ▪ C = 50 a 55%; ▪ H = 6 a 8%; ▪ O = 20 a 24%; Conteúdo das proteínas ▪ N = 15 a 18%; ▪ S = 0,2 a 0,3%. Considerando que a maioria das proteínas tem 16% de nitrogênio, o fator geral na transformação de nitrogênio para proteína é de 6,25. 16 g de N 100 g de proteínas n g de N x g de proteínas x = (n. 100)/16 = n. 6,25 g proteínas O fator de conversão pode gerar erros, quando o conteúdo de N é muito diferente de 16%. Para isso existem fatores de conversão especiais: ▪ trigo: 5,70; ▪ leite: 6,38; ▪ gelatina: 5,55. → Quanto mais nitrogênio menor o fator de conversão. Apesar da complexidade estrutural, as proteínas podem ser quebradas em aminoácidos pela ação de enzimas ou fervura com ácidos e álcalis, sob certas condições. Nos alimentos, tendem a decompor à temperatura ambiente, auxiliada pela ação bacteriana, podem formar produtos tóxicos para o corpo, necessitando de uma boa conservação. Proteína animal X Proteína vegetal. Funções biológicas: catalisadoras, regeneradoras, imunologia, energia, reguladores, reprodução e etc. Aminoácidos reagem com: ▪ ninidrila: simples e sensível para pequenas quantidades; ▪ oxidação: produzindo CO2 e amônia; ▪ metais: formando quelatos; ▪ ligações peptídicas: formando peptídeos e proteínas. As propriedades de uma proteína são determinadas pelo número e espécie dos resíduos de aminoácido e sequência. A degradação da proteína leva a formação de aminoácidos (importância para as reações que ocorrem nas determinações). Algumas proteínas importantes nos alimentos: ▪ proteínas da carne: miosina, actina, colágeno, tripsina; ▪ proteínas do leite: caseína, lactoalbumina, lactoglobulina; ▪ proteínas do ovo: clara (ovalbumina, canalbumina, glicoproteina) e gema (lipovitelina, fosfovitina, livitina); ▪ proteínas do trigo: prolamina e glutenina → GLÚTEN. Metodologias para determinação das proteínas 1. Método de Kjeldal Descoberto em 1883; mais utilizado para a determinação de proteína. Determina proteína através do nitrogênio total - nitrogênio protéico e não protéico - a quantidade de nitrogênio medido e a proteína estimada irá depender do tipo de amostra - cálculo do conteúdo protéico: multiplica-se o conteúdo de nitrogênio pelo fator arbitrário (5,7: trigo e 6,25 para os demais alimentos) Princípio: baseia-se na determinação do conteúdo de nitrogênio da amostra após o processo de digestão, onde a matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio existente é finalmente transformado em amônia para posterior reação com o ácido bórico e quantificação através da titulação. Ocorre em três etapas: Digestão Destilação Titulação Metodologias para determinação das proteínas 1. Método de Kjeldal Aquecimento da amostra com H2SO4 Adicionar NaOH concentrado e aquece Recolhimento da amônia: solução de ácido bórico Titulação com HCl Redução do N em sulfato de amônia Liberação da amônia Digestão – a amostra é submetida a elevadas temperaturas com adição de ácido sulfúrico e catalisadores para digestão de sua matéria orgânica. Todo o nitrogênio da amostra é transformado em sal amoniacal. Proteína + H2SO4 + Catalisador + Aquecimento → (NH4)2SO4 CuSO4 = catalisador K2SO4 = aumenta o ponto de ebulição da mistura Digestor Destilação – A amônia é liberada do sal amoniacal pela reação com hidróxido de sódio e recebida numa solução ácida de volume e concentração conhecidos. (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O NH3 + H3BO3 → NH4 + H2BO3 - (ac. bórico) (borato) Destilador de Nitrogênio de Kjeldahl Titulação – Determina-se a concentração de N presente na amostra titulando-se o excesso do ácido utilizado na destilação. A quantidade de íon borato é proporcional à quantidade de nitrogênio. H2BO3 - + H+ → H3BO3 • Transformar o volume de ácido utilizado em nitrogênio (1 mL de HCl 0,02N = 0,2802 mg de nitrogênio) • Aplicar o fator de correção para descontar o conteúdo de nitrogênio não protéico da amostra. • A porcentagem de proteína é dada pela fórmula: %P = V x 14 x FN x F x 100 x 0,02 p Onde: - V é o volume de ácido utilizado na titulação menos o volume do branco (em ml) - FN fator de conversão N Proteína (varia de acordo com a fonte protéica, principais valores na tabela abaixo). - F é o fator de correção do ácido - p é o peso da amostra (mg) Fatores de conversão de N total em proteína Metodologias para determinação das proteínas 1. Método de Kjeldal Cálculos No. de miliequivalentes do HCl = No. Miliequivalentes do nitrogênio mL do ácido x normalidade do ácido = peso N (g) / meq do N − Peso N (g) = mL do ácido x normalidade do ácido x 0,014 − Peso N (mg) = mL do ácido x normalidade do ácido x 14 − % N x fator = % proteína total Metodologias para determinação das proteínas 1. Método de Kjeldal Variações no método • Adição de catalisadores •Mercúrio, cobre, selênio • Adição de sulfato de potássio •Ácido bórico Metodologias para determinação das proteínas 2. Método de Dumas Determina N total Combustão da amostra a 700 - 800 º.C Erros: quantidade de amostra pequena 3. Método por biureto Substância com duas ou mais ligações peptídicas formam complexo de coloração roxa com sais de cobre em soluções alcalinas Intensidade da cor: quantidade de proteínas Metodologias para determinação das proteínas 3. Método por biureto vantagens: não apresenta problemas com interferentes simples, rápido e barato determinação de proteína e não de N total desvantagens: curva de calibração de um padrão conhecido cor formada: não é idêntica para todas as proteínas Metodologias para determinação das proteínas 4. Método por fenol (Follin – Ciocalteau – Lowry) Determinação colorimétrica Fundamento: interação das proteínas com o reagente de fenol e cobre em soluções alcalinas; oxidação de aminoácidos por um reagente heteropolifosfato (fosfotungístico) = coloração azul vantagens: mais sensível que o biureto bastante específico; pouco são os interferentes desvantagens: intensidade de cor = variação baseada na composição de aminoácidos, lento. Metodologias para determinação das proteínas 4. Métodos turbidimétricos Turbidez visualizada pela precipitação de proteína Agentes precipitantes: ácido tricloacético; ferrocianeto de potássio e ácido sulfosalisílico vantagens: rápido e simples para amostrar líquidas desvantagens: amostras sólidas: não é recomendado pode ocorrer precipitação de outras substâncias com as proteínas calibração com padrões de proteínas Metodologias para determinação das proteínas 4. Métodos Dye-Binding Tratamento da amostra com excesso de corante (indicador) Formação de um complexo insolúvel, mas que é separadopor centrifugação ou filtração Excesso de corante: é medido colorimetricamente (espectrofotômetro) Metodologias para determinação das proteínas 4. Métodos Dye-Binding Quantidade de proteína: obtida indiretamente por diferença Alimentos: grão de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais e animais e derivados de leite corantes: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B Metodologias para determinação das proteínas 4. Métodos Dye-Binding Vantagens: simples, rápido, exato e econômico Desvantagens: uso de equipamento próprio 5. Métodos físicos Não muito usados Metodologias para determinação das proteínas Espectrofotometria UV Vantagens: simples, rápido, não destrutivo Desvantagens: Dependente da concentração de aminoácidos aromáticos; Ácidos nucléicos podem interferir.
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