Análise de Proteína - Aula 5

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Análise de Proteína 
Bromatologia 
Prof. Msc Vinicius Rodrigues 
Março/2015 
Definição São polímeros de alto peso 
molecular, cujas unidades básicas são 
compostas por moléculas de α- 
aminoácidos ligadas através de ligações 
peptídicas. 
Proteínas 
Aminoácidos 
Proteína 
 Maiores constituintes de toda a célula viva, cada uma 
com uma função associada as atividades vitais; 
 Nos alimentos, além da função nutricional, possui 
propriedades sensoriais e de textura; 
 Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos. 
 
 
Proteína 
▪ C = 50 a 55%; 
▪ H = 6 a 8%; 
▪ O = 20 a 24%; Conteúdo das proteínas 
▪ N = 15 a 18%; 
▪ S = 0,2 a 0,3%. 
Considerando que a maioria das proteínas tem 16% de 
nitrogênio, o fator geral na transformação de nitrogênio 
para proteína é de 6,25. 
 
 
16 g de N 100 g de proteínas 
n g de N x g de proteínas 
 
 
x = (n. 100)/16 = n. 6,25 g proteínas 
 
 
O fator de conversão pode gerar erros, quando o conteúdo 
de N é muito diferente de 16%. Para isso existem fatores 
de conversão especiais: 
▪ trigo: 5,70; 
▪ leite: 6,38; 
▪ gelatina: 5,55. 
 
 
→ Quanto mais nitrogênio menor o fator de conversão. 
 Apesar da complexidade estrutural, as proteínas 
podem ser quebradas em aminoácidos pela ação de 
enzimas ou fervura com ácidos e álcalis, sob certas 
condições. 
 
 Nos alimentos, tendem a decompor à temperatura 
ambiente, auxiliada pela ação bacteriana, podem 
formar produtos tóxicos para o corpo, necessitando de 
uma boa conservação. 
 
 
 
 Proteína animal X Proteína vegetal. 
 
 Funções biológicas: catalisadoras, regeneradoras, 
imunologia, energia, reguladores, reprodução e etc. 
Aminoácidos reagem com: 
▪ ninidrila: simples e sensível para pequenas quantidades; 
▪ oxidação: produzindo CO2 e amônia; 
▪ metais: formando quelatos; 
▪ ligações peptídicas: formando peptídeos e proteínas. 
 
 As propriedades de uma proteína são determinadas pelo 
número e espécie dos resíduos de aminoácido e 
sequência. 
 A degradação da proteína leva a formação de 
aminoácidos (importância para as reações que ocorrem 
nas determinações). 
Algumas proteínas importantes nos alimentos: 
 
▪ proteínas da carne: miosina, actina, colágeno, tripsina; 
 
▪ proteínas do leite: caseína, lactoalbumina, lactoglobulina; 
 
▪ proteínas do ovo: clara (ovalbumina, canalbumina, 
glicoproteina) e gema (lipovitelina, fosfovitina, livitina); 
 
▪ proteínas do trigo: prolamina e glutenina → GLÚTEN. 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
1. Método de Kjeldal 
 
Descoberto em 1883; mais utilizado para a determinação 
de proteína. 
Determina proteína através do nitrogênio total 
 - nitrogênio protéico e não protéico 
 - a quantidade de nitrogênio medido e a proteína estimada 
irá depender do tipo de amostra 
 - cálculo do conteúdo protéico: multiplica-se o conteúdo 
de nitrogênio pelo fator arbitrário (5,7: trigo e 6,25 para os 
demais alimentos) 
Princípio: baseia-se na determinação do 
conteúdo de nitrogênio da amostra após o 
processo de digestão, onde a matéria orgânica é 
decomposta e o nitrogênio existente é finalmente 
transformado em amônia para posterior reação 
com o ácido bórico e quantificação através da 
titulação. 
Ocorre em três etapas: 
 Digestão 
 Destilação 
 Titulação 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
1. Método de Kjeldal 
 
Aquecimento da amostra com H2SO4 
 
Adicionar NaOH concentrado e aquece 
 
Recolhimento da amônia: solução de ácido bórico 
 
Titulação com HCl 
Redução do N em sulfato de amônia 
Liberação da amônia 
Digestão – a amostra é submetida a elevadas 
temperaturas com adição de ácido sulfúrico e catalisadores 
para digestão de sua matéria orgânica. 
 
Todo o nitrogênio da amostra é transformado em sal 
amoniacal. 
 
Proteína + H2SO4 + Catalisador + Aquecimento → 
(NH4)2SO4 
 
CuSO4 = catalisador 
K2SO4 = aumenta o ponto de ebulição da mistura 
Digestor 
Destilação – A amônia é liberada do sal amoniacal 
pela reação com hidróxido de sódio e recebida 
numa solução ácida de volume e concentração 
conhecidos. 
 
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O 
NH3 + H3BO3 → NH4 + H2BO3
- 
 (ac. bórico) (borato) 
Destilador 
de 
Nitrogênio 
de 
Kjeldahl 
Titulação – Determina-se a concentração de N 
presente na amostra titulando-se o excesso do 
ácido utilizado na destilação. 
 
A quantidade de íon borato é proporcional à 
quantidade de nitrogênio. 
 
H2BO3
- + H+ → H3BO3 
• Transformar o volume de ácido utilizado em nitrogênio (1 mL de 
HCl 0,02N = 0,2802 mg de nitrogênio) 
• Aplicar o fator de correção para descontar o conteúdo de 
nitrogênio não protéico da amostra. 
• A porcentagem de proteína é dada pela fórmula: 
 
%P = V x 14 x FN x F x 100 x 0,02 
 p 
 
Onde: 
- V é o volume de ácido utilizado na titulação menos o volume do 
branco (em ml) 
- FN fator de conversão N  Proteína (varia de acordo com a fonte 
protéica, principais valores na tabela abaixo). 
- F é o fator de correção do ácido 
- p é o peso da amostra (mg) 
Fatores de conversão de N total em proteína 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
1. Método de Kjeldal 
 
Cálculos 
No. de miliequivalentes do HCl = No. Miliequivalentes do 
nitrogênio mL do ácido x normalidade do ácido = peso N 
(g) / meq do N 
 
− Peso N (g) = mL do ácido x normalidade do ácido x 
0,014 
− Peso N (mg) = mL do ácido x normalidade do ácido x 14 
− % N x fator = % proteína total 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
1. Método de Kjeldal 
 
Variações no método 
 
• Adição de catalisadores 
•Mercúrio, cobre, selênio 
• Adição de sulfato de potássio 
•Ácido bórico 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
2. Método de Dumas 
 
Determina N total 
Combustão da amostra a 700 - 800 º.C 
Erros: quantidade de amostra pequena 
 
3. Método por biureto 
 
Substância com duas ou mais ligações peptídicas formam 
complexo de coloração roxa com sais de cobre em 
soluções 
alcalinas 
Intensidade da cor: quantidade de proteínas 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
3. Método por biureto 
 
 vantagens: 
não apresenta problemas com interferentes 
simples, rápido e barato 
determinação de proteína e não de N total 
 
 desvantagens: 
curva de calibração de um padrão conhecido 
cor formada: não é idêntica para todas as proteínas 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
4. Método por fenol (Follin – Ciocalteau – Lowry) 
 
Determinação colorimétrica 
Fundamento: interação das proteínas com o reagente de 
fenol e cobre em soluções alcalinas; 
oxidação de aminoácidos por um reagente 
heteropolifosfato (fosfotungístico) = coloração azul 
 vantagens: mais sensível que o biureto 
bastante específico; pouco são os interferentes 
 desvantagens: intensidade de cor = variação baseada 
na composição de aminoácidos, lento. 
 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
4. Métodos turbidimétricos 
 
Turbidez visualizada pela precipitação de proteína 
Agentes precipitantes: ácido tricloacético; ferrocianeto de 
potássio e ácido sulfosalisílico 
 vantagens: rápido e simples para amostrar líquidas 
 desvantagens: amostras sólidas: não é recomendado 
pode ocorrer precipitação de outras substâncias com as 
proteínas 
calibração com padrões de proteínas 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
4. Métodos Dye-Binding 
 
Tratamento da amostra com excesso de corante 
(indicador) 
Formação de um complexo insolúvel, mas que é separadopor centrifugação ou filtração 
Excesso de corante: é medido colorimetricamente 
(espectrofotômetro) 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
4. Métodos Dye-Binding 
 
Quantidade de proteína: obtida indiretamente por 
diferença 
 
Alimentos: grão de cereais, sementes oleaginosas, 
produtos vegetais e animais e derivados de leite 
corantes: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e 
preto amino 10B 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
4. Métodos Dye-Binding 
 
 Vantagens: simples, rápido, exato e econômico 
 Desvantagens: uso de equipamento próprio 
 
5. Métodos físicos 
Não muito usados 
Metodologias para determinação das proteínas 
 
Espectrofotometria UV 
 
 Vantagens: 
 simples, rápido, não destrutivo 
 
 Desvantagens: 
 Dependente da concentração de aminoácidos 
aromáticos; 
 Ácidos nucléicos podem interferir.